1. Метаболический анализ сфероидов 3D опухолей поджелудочной железы для биоэнергетических путей с использованием анализатора внеклеточного потока
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается анализ метаболических функций сфероидов с использованием анализатора внеклеточного потока с микропланшетами для анализа, специально разработанными для 3D-сфероидов.
- Промывка и перенос сфероидов из ростовых пластин в микропланшеты сфероидного анализа.
заметка: Сфероиды могут быть использованы для метаболических анализов, когда они достигают диаметра ~500 мкм.
- За день до проведения анализа увлажните зонд или картридж датчика с калибром анализа (200 мкл/лунка) в прилагаемой рабочей пластине и инкубируйте в течение ночи (4-18 ч) в увлажненном инкубаторе (без CO2) при температуре 37 °C.
- Подготовьте подходящую среду для анализа для желаемого метаболического анализа, добавив в основную среду (см. Таблицу материалов) либо 2 мМ L-глутамина для анализа гликолизного стресс-теста (GST), либо 1 мМ пирувата, 2 мМ L-глутамина и 10 мМ глюкозы для анализа митохондриального стресс-теста (MST).
заметка: Анализатор внеклеточного потока измеряет как митохондриальное дыхание (OCR), так и гликолиз (ECAR) живых клеток в формате 96-луночных планшетов. Эти показатели дают представление о клеточной метаболической функции в исследуемых образцах. Пожалуйста, обратитесь к руководству в наборах для анализа для получения подробных инструкций.
- После добавления специальных добавок для анализа (см. Шаг 1.1.1) нагрейте питательную среду на водяной бане при температуре 37°C и отрегулируйте pH до 7,4 ± 0,1 с 0,1N NaOH. Держите среду в тепле до использования.
- Восстановите реактивы из набора для пробирного анализа в откалиброванной среде до рекомендуемых исходных концентраций.
заметка: Они производятся при 10× конечной желаемой концентрации в скважинах. Исходные концентрации глюкозы, олигомицина и 2-дезоксиглюкозы (2-DG) составляют 100 мМ, 100 мкМ и 500 мМ соответственно.
- Наблюдайте за сфероидами в ростовой пластинке под световым микроскопом, чтобы проверить морфологию сфероидов и общую однородность с точки зрения формы и структуры сфероидов.
- Перенесите ростовую пластину на магнитный удерживающий привод и осторожно отасуньте ~120 μл питательной среды. Аккуратно промойте сфероиды ~120 мкл подогретой и предварительно откалиброванной среды для анализа, отсадите и повторите промывку дважды. Еще раз осмотрите сфероиды под микроскопом, чтобы убедиться, что сфероиды не смыты.
- Приготовьте микропланшет для сфероидального анализа, добавив в каждую лунку 180 мкл теплой пробирной среды.
- Установите микропипетку P20 на 10 μл и установите на нее широкий расточенный наконечник. Если широкие расточенные наконечники недоступны, отрежьте кончики обычных наконечников пипеток чистыми ножницами или скальпелем, чтобы расширить отверстие.
заметка: Это должно уменьшить сдвиг и сохранить общую морфологию сфероидов при переносе на пробирные пластины.
- Используйте теплую (37°C) поверхность для проведения переноса сфероидов. Используйте поверхность для просмотра рентгеновской пленки, нагретую лампой белого света, чтобы повысить контрастность и помочь визуализации сфероидов во время процесса переноса.
- Осторожно отасуньте один предварительно промытый сфероид из пластинки для роста репеллента с помощью микропипетки P20, оснащенной наконечником с широким отверстием, и аккуратно перенесите сфероид непосредственно в центр каждой лунки планшета для анализа сфероидов для проведения метаболического анализа. Позвольте каждому сфероиду осторожно упасть в центральную микрокамеру каждой лунки под действием чистой силы тяжести, чтобы заполнить пластину для анализа.
заметка: Обычно требуется 5-8 с, чтобы каждый сфероид под действием силы тяжести упал в центр скважины. Не стоит вытаскивать пипетку до тех пор, пока сфероиды не осядут в микрокамере. Не откладывайте сфероиды в 4 угловые лунки пробирной пластины (A1, A12, H1, H12), так как они будут использоваться в качестве фоновых лунок.
- Следите за морфологией и положением каждого сфероида, чтобы убедиться, что каждый сфероид находится в центре каждой скважины. При необходимости необходимо переместить скважину к центру скважины путем аспирации сфероида с помощью широкого наконечника пипета и последующего осаждения под действием силы тяжести.
- После того, как все сфероиды будут перенесены, поместите планшет для анализа в инкубатор с увлажненным воздухом при температуре 37 °C (без CO2) на один час перед анализом.
- Зарядка сенсорного картриджа с компаундами и проведение пробного анализа
- Приготовьте 10× концентрированных реагентов для анализа в средах для анализа конкретных анализов, описанных в шаге 1.1.2. Например, для проведения GST восстановите глюкозу, олигомицин и 2-DG в рекомендуемых объемах, указанных в руководстве по анализу. Анализы GST и MST проводились с использованием сфероидов Patu8902-PS1.
- Правильно сориентируйте картридж датчика рядами с маркировкой A-H с левой стороны и поместите направляющую заряжания поверх картриджа датчика. Обеспечьте правильную загрузку нужного порта, расположив направляющую погрузки так, чтобы буква, соответствующая загружаемому порту, находилась в верхнем левом углу.
- С помощью многоканальной пипетки реагенты дозируются непосредственно в отверстия для инъекций. Удерживайте направляющие загрузки на месте кончиками пальцев на протяжении всей процедуры.
заметка: Каждый реагент будет вводиться в рекомендованный порт, указанный в руководстве по анализу. Избегайте образования пузырьков воздуха, но и не нажимайте на какую-либо часть картриджа, чтобы удалить пузырьки воздуха.
- Снимите направляющую заряжания и расположите ее на уровне глаз картриджа, чтобы визуально осмотреть отверстия впрыска для равномерной загрузки.
- Создание протокола экспериментального анализа/прибора с использованием программного обеспечения Wave контроллера прибора (далее – программное обеспечение для анализа), как описано в разделе 1.3.
- Разработка и проведение анализа с использованием аналитического программного обеспечения
- Создание шаблона анализа для эксперимента
- Откройте программное обеспечение для анализа и нажмите «Шаблоны» или выберите один из существующих шаблонов анализа. Дважды кликните по «Пустому шаблону».
- Определение экспериментальных групп и условий.
- Определите стратегии внедрения для портов A, B и C. Оставьте порт D пустым.
заметка: Для анализа GST только эти порты будут загружены глюкозой, олигомицином и 2-DG. В случае анализа MST будут загружены олигомицин, FCCP и ротенон.
- Определите предварительную обработку, если сфероиды обрабатывались одним или несколькими исследуемыми соединениями и контрольной группой. Определите среду для анализа, включив в нее источник, добавки и другую информацию.
- Определите один или несколько типов ячеек (например, Patu8902, PS1), просмотрев информацию о плотности и количестве проходов.
- Нажмите «Создать группы».
- Перейдите на вкладку "Карта пластин" и назначьте пробирной пластине группы в соответствии с планом эксперимента.
- Выберите четыре угловые колодца в качестве фоновых колодцев. Следите за тем, чтобы в этих лунках не было сфероидов.
- Проведение анализа на анализаторе
- Перейдите на вкладку «Протокол прибора». Сохраните команды протокола по умолчанию, отметив «Калибровка», «Равновесие» и «Базовый цикл измерения».
- Нажмите "Injections" и определите состав для каждого порта. Отредактируйте циклы измерений до 6 циклов из 3 циклов по умолчанию для сфероидов. Оставьте по умолчанию время смешивания 3 минуты, ожидания 0 минут и время измерения 3 минуты.
заметка: По умолчанию время смешивания-ожидания-измерения составляет 3 минуты, 0 минут, 3 минуты соответственно. Обычно перед введением первого исследуемого соединения обычно проводятся три измерения базальной скорости. Эти измерения могут быть откалиброваны и скорректированы в соответствии с планом эксперимента.
- Обзор протокола и резюме группы.
- Сохранить шаблон дизайна пробирного анализа.
- Приступайте к калибровке перед анализом после того, как отверстия для инъекций будут заполнены подложками для анализа. Перенесите картридж с рабочей пластиной в анализатор внеклеточного потока.
заметка: Обычно это происходит в течение 15-20 минут и калибровка датчиков для проведения измерений OCR и ECAR.
- После калибровки картриджа замените рабочую пластину на предварительно нагретую пластину для анализа, содержащую 3D-сфероиды, и начните анализ. После завершения измерений экспортируйте данные в электронные таблицы или графическое и статистическое программное обеспечение для анализа данных.
