Методическая статья

Выделение стволовых клеток PDAC: метод выделения раковых стволовых клеток из опухолей поджелудочной железы

30 апреля 2023 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Lonardo, E., et al. Изучение характеристик стволовых клеток рака поджелудочной железы для разработки новых стратегий лечения. J. Vis. Exp. (2015).

В этой статье описывается метод выделения стволовых клеток рака поджелудочной железы (CSCs) из ткани протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC) человека. Эти ЦСК используются для изучения функциональных эффектов медикаментозного лечения на способность ЦСК к к самообновлению in vitro для разработки более эффективных методов лечения рака.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выделение РСК из КПК человека (Рисунок 1)

  1. В стерильном шкафу биобезопасности перенесите человеческую ткань PDAC в чашку для культивирования размером 60 x 15 мм, содержащую 1 мл стерильного 1X-фосфатно-солевого буфера (PBS). Измельчите опухоль на небольшие кусочки (1 – 5 мм) с помощью стерильного скальпеля и щипцов.
  2. Добавьте 1 мл стерильного 1X PBS в чашку для посева и повторяйте этап растирания до полного диссоциирования ткани, регулярно для этого требуется 3-4 раунда. Перенесите тканевую суспензию (долейте до конечного объема 5 мл с помощью 1X PBS) в стерильную пробирку и механически гомогенизируйте ее с помощью диссоциатора, такого как gentleMACS.
  3. Гомогенизированную ткань инкубировать коллагеназой (использовать 2,5 мг/мл коллагеназы в 1X PBS) в течение 60 мин при 37°C, а затем центрифугировать в течение 5 мин при 900 x g. Сцедить надосадочную жидкость и ресуспендировать клеточные гранулы в 10 мл готовой среды. Отфильтровать суспензию клеток через сетчатое фильтр 40 мкм и центрифугировать в течение 5 мин при давлении 900 x g.
  4. Сцедите надосадочную жидкость и суспендируйте гранулу с 5 мл буфера для лизиса эритроцитов (аммоний-хлорид-калий, ACK) и инкубируйте
  5. Повторно суспендируйте гранулу в среде CSC, положите на чашку, покрытую желатином, и инкубируйте при 37°C в течение 1 ч. На этом этапе будет удалена большая часть клеток фибробластов, которые быстро прикрепляются к пластине.
  6. Достаньте планшет из инкубатора и осторожно восстановите клеточную суспензию и количественно измерьте количество жизнеспособных (трипановых синеотрицательных) клеток с помощью гемоцитометра. Для этого аккуратно перемешайте суспензию и пипетку 20 мкл суспензии в пробирке Eppendorf. Добавьте 20 μл (в соотношении 1:1) трипанового синего в ячейки микроцентрифужной пробирки и хорошо перемешайте. Пипеткой нанесите примерно 10 μл смеси на гемоцитометр.
  7. Подсчитайте все свободные клетки в четырех угловых квадрантах счетной камеры для подсчета жизнеспособных клеток.
    заметка: Жизнеспособность и выход клеток могут значительно варьироваться в зависимости от образца опухоли. Для образцов PDAC жизнеспособность обычно колеблется в пределах 45-70%, а кусочки ткани из макроскопического образца опухоли диаметром 3 - 5 мм должны дать примерно 5x106 жизнеспособных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1. Метформин избирательно воздействует на ЦСК.
(А) Метформин уменьшал размер сфер. Репрезентативные изображения сфер, полученные после лечения указанными дозами метформина в течение 7 дней (правая панель). Количественная оценка размера сферы (n≥6) (левая панель), указанные числа на оси абсцисс представляют отдельную опухоль. (В) Способность к образованию...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Счетная камера/
Гемоцитометр 		Хауссер Сайентиал Ко3200
Счетчик и анализатор клеток CASY для измерения пролиферации и жизнеспособностиРоше Инноватис:AG CASY Модель TTC 45,60,150 μм
Диссоциатор GentleMACSМилтеньи КоТел.: 130-093-235
Трубки GentleMACS CМилтеньи КоТел.: 130-093-237
100-мм чашки для культивирования тканейBD Falcon353803
Сетчатый фильтр для клетокBD FalconNo 352350 (Английский
Полипропиленовая коническая туба 15 млBD Falcon352097
Полипропиленовая коническая туба 50 млBD FalconNo 352070 (Английский
1,5 мл стерильные пробиркиЭппендорф0030 120.086
Центрифужные пробирки 50 млКорнинг430828
Стерильные чашки Петри, посуды 10 смКорнинг353003
Коллагеназа IV типаТехнологии стволовых клеток7909
RPMI Medium 1640Технологии жизни11875-085 (Английский)
Раствор пенициллина/стрептомицина, 100XТехнологии жизниSV30010
L-глутамин, 200 мМ, 100XТехнологии жизниNo 25030-081
Доплата B27 50xТехнологии жизни17504-044
Основной фактор роста фибробластовсигмаФ0291
Модифицированный Eagle Medium/F12 от DulbeccoсигмаД8437
Стерильный 1x Фосфатный буферный раствор ДульбеккосигмаД8537
Трипан синийТехнологии жизни15250-061
Инкубатор с вводом CO2
Микроножницы
Изогнутые щипцы
Щипцы от осколков
) )

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ACK

Похожие статьи