Анализ образования сфер: метод in vitro для идентификации стволовых клеток рака поджелудочной железы и скрининговой терапии

1.Анализ и анализ сферообразования

1. Анализ образования сфер и лечение метформином
   1. Возьмите необходимое количество клеток и добавьте соответствующий объем среды CSC, чтобы получить концентрацию клеток 2000 клеток/мл. Не держите клеточную суспензию на льду не более 1 часа и хорошо перемешайте перед нанесением покрытия.
   2. Добавьте 500 мкл 1X PBS в первый и последний ряд 24-луночного планшета для увлажнения, чтобы свести к минимуму испарение среды. Засейте клетки в клеточные планшеты со сверхнизким уровнем прикрепления с плотностью 2000 клеток на лунку в 1 мл опухолевой среды (2000 клеток/мл).
      заметка: Количество клеток, используемых для анализа образования опухолевой сферы, может варьироваться в зависимости от типа опухоли.
   3. Обработайте не менее 4 лунок носителем (отрицательный контроль) и 4 лунки с каждой выделенной обработкой, например, 3 мМ метформина. Поместите клетки в инкубатор, настроенный на 37 °C, и подайте в клетки 5%_CO2 в течение одной недели.
      заметка: Среду не следует менять для того, чтобы обеспечить беспрепятственное образование опухолевых сфер, но ее можно ежедневно пополнять факторами роста, поскольку они нестабильны в питательной среде.
   4. Через день добавляйте обработку, например, 3 мМ метформина или средства в каждую из лунок. Оценка количества сформированных опухолевых сфер через 5 и/или 7 дней с помощью автоматизированного счетчика клеток, позволяющего подсчитывать более крупные структуры (рис. 1).
      заметка: Следует рассматривать только опухолевые сферы размером не менее 40 мкм, которые могут быть классифицированы как малые (40 - 80 мкм) или большие (80 - 120 мкм) соответственно. Результаты можно проиллюстрировать как процент опухолевых сфер, деленный на начальное количество засеянных клеток (например, 2000 клеток).
2. Серийное пассирование опухолевых сфер первого поколения
   1. После 7 дней инкубации соберите опухолевые сферы с помощью клеточного фильтра 40 мкм и центрифугируйте их в течение 5 мин при 900 x g при RT.
   2. Диссоциировать гранулу опухолевых сфер на одиночные клетки с помощью трипсина, а затем снова расширить полученную суспензию одиночных клеток еще на 7 дней.

Рисунок 1. Лечение метформином подавляет потребление кислорода и индуцирует выработку АФК. (А) Метформин дополнительно ингибирует потребление кислорода (OCR) клетками, полученными из сфер. Две различные вторичные сферы PDAC были обработаны метформином, а изменения OCR были измерены с помощью анализа внеклеточного потока. Инъекция ротенона использовалась в качестве контроля общего потребления митохондриального OCR. Ось X представляет собой норму потребления кислорода в пмоль кислорода/час, нормированную по содержанию белка в каждой скважине. (B) Сферы PDAC, используемые в А, обрабатывали метформином в течение 8 ч, а продукцию АФК оценивали методом проточной цитометрии с использованием карбокси-DCFDA. Слева, репрезентативные графики проточной цитометрии. Справа, сводка данных трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.