Анализ образования сфер: метод in vitro для идентификации стволовых клеток рака поджелудочной железы и скрининговой терапии

Аннотация

Источник: Lonardo, E. et al. Изучение характеристик стволовых клеток рака поджелудочной железы для разработки новых стратегий лечения. J. Vis. Exp.(2015).

Это видео демонстрирует протокол разработки сфероидов стволовых клеток рака поджелудочной железы in vitro. Анализ может служить инструментом скрининга для выявления соединений, которые потенциально нацелены на раковые стволовые клетки.

Протокол

1.Анализ и анализ сферообразования

1. Анализ образования сфер и лечение метформином
   1. Возьмите необходимое количество клеток и добавьте соответствующий объем среды CSC, чтобы получить концентрацию клеток 2000 клеток/мл. Не держите клеточную суспензию на льду не более 1 часа и хорошо перемешайте перед нанесением покрытия.
   2. Добавьте 500 мкл 1X PBS в первый и последний ряд 24-луночного планшета для увлажнения, чтобы свести к минимуму испарение среды. Засейте клетки в клеточные планшеты со сверхнизким уровнем прикрепления с плотностью 2000 клеток на лунку в 1 мл опухолевой среды (2000 клеток/мл).
      заметка: Количество клеток, используемых для анализа образования опухолевой сферы, может варьироваться в зависимости от типа опухоли.
   3. Обработайте не менее 4 лунок носителем (отрицательный контроль) и 4 лунки с каждой выделенной обработкой, например, 3 мМ метформина. Поместите клетки в инкубатор, настроенный на 37 °C, и подайте в клетки 5%_CO2 в течение одной недели.
      заметка: Среду не следует менять для того, чтобы обеспечить беспрепятственное образование опухолевых сфер, но ее можно ежедневно пополнять факторами роста, поскольку они нестабильны в питательной среде.
   4. Через день добавляйте обработку, например, 3 мМ метформина или средства в каждую из лунок. Оценка количества сформированных опухолевых сфер через 5 и/или 7 дней с помощью автоматизированного счетчика клеток, позволяющего подсчитывать более крупные структуры (рис. 1).
      заметка: Следует рассматривать только опухолевые сферы размером не менее 40 мкм, которые могут быть классифицированы как малые (40 - 80 мкм) или большие (80 - 120 мкм) соответственно. Результаты можно проиллюстрировать как процент опухолевых сфер, деленный на начальное количество засеянных клеток (например, 2000 клеток).
2. Серийное пассирование опухолевых сфер первого поколения
   1. После 7 дней инкубации соберите опухолевые сферы с помощью клеточного фильтра 40 мкм и центрифугируйте их в течение 5 мин при 900 x g при RT.
   2. Диссоциировать гранулу опухолевых сфер на одиночные клетки с помощью трипсина, а затем снова расширить полученную суспензию одиночных клеток еще на 7 дней.

Результаты

Рисунок 1. Лечение метформином подавляет потребление кислорода и индуцирует выработку АФК. (А) Метформин дополнительно ингибирует потребление кислорода (OCR) клетками, полученными из сфер. Две различные вторичные сферы PDAC были обработаны метформином, а изменения OCR были измерены с помощью анализа внеклеточного потока. Инъекция ротенона использовалась в качестве к...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
24-луночные сверхнизкие крепежные пластины	Корнинг	No 3474
Стерильный 1x Фосфатный буферный раствор Дульбекко	сигма	Д8537
Метформин	сигма	D150959-5G
Раствор трипсина, 0,05%	Технологии жизни	25300054
Инкубатор с вводом CO2
Счетчик и анализатор клеток CASY для измерения пролиферации и жизнеспособности	Роше Инноватис:	AG CASY Модель TTC 45,60,150 μм
Счетная камера/гемоцитометр	Хауссер Сайентиал Ко	3200
Центрифужные пробирки 50 мл	Корнинг	430828
Полипропиленовая коническая туба 15 мл	BD Falcon	352097
Полипропиленовая коническая туба 50 мл	BD Falcon	No 352070 (Английский

)