1. Получение 3D опухолевых сфероидов, встроенных в ЭКМ
- Подготовьте рабочую станцию с необходимыми материалами внутри колпака с ламинарным потоком.
- Приготовьте разбавленную смесь модифицированных карбоксилатами флуоресцентных индикаторных зондов диаметром 1 мкм, добавив 2 части исходных зондов (2% твердых веществ) в 25 частей стерильной воды.
- Достаньте из холодильника флакон с бычьим коллагеном 3,1 мг/мл и поставьте его на лед.
- Аликвотьте 125 мкл коллагена в пустой флакон объемом 2 мл.
- Добавьте 50 мкл разбавленного раствора индикаторного зонда во флакон, содержащий коллаген и вихрь, на короткое время для распределения зондов.
- Добавьте 235 мкл соответствующей среды для клеточных культур, содержащей феноловый красный (который станет желтым) в общем объеме 410 мл и кратковременно перемешайте в вортексе перед тем, как удалить 205 мл (половина общего объема) и поместить его в новый флакон объемом 2 мл. Флакон 1 будет содержать сфероид опухоли, а флакон 2 будет контрольной смесью.
- Добавьте ~2 мкл 1 М NaOH во флакон 1, чтобы вернуть раствор к нейтральному pH (питательная среда, содержащая фенольный красный, должна вернуться к красному цвету). Обратите внимание, что это приведет к тому, что смесь начнет затвердевать, если ее не держать на льду. Быстро перемешайте вихрь, затем немедленно вернитесь к решетке для льда.
заметка: Сфероид едва заметен невооруженным глазом после 9 дней культивирования и его извлечение из агарозной грядки является деликатной задачей. Использование диссекционного микроскопа может быть полезным для некоторых пользователей. Сохранение целостности сфероида во время переноса имеет первостепенное значение.
- С помощью наконечника пипетки с широким горлышком аккуратно удалите 40 мкл среды из лунки, содержащей сфероид опухоли. Сохраните эти 40 мкл при выполнении следующего этапа.
- Проверьте лунку, чтобы убедиться, что сфероид был удален на предыдущем этапе. Если это так, добавьте 40 μл, содержащий сфероид, во флакон 1. Если нет, поместите 40 μл обратно в лунку и повторите предыдущий шаг.
- Осторожно перемешайте флакон 1 (не рискуйте вызвать завихрения, это может повредить сфероид) перед тем, как перелить смесь порциями по 60 мкл в три отдельные лунки 96-луночного планшета. Осмотрите каждую лунку с помощью микроскопа после добавления смеси, чтобы определить, какая лунка содержит сфероид.
- Добавьте ~2 мкл 1 М NaOH и 40 мкл среды для клеточных культур во флакон 2 и вортекс перед выделением 60 мкл этой смеси в пустую лунку в 96-луночном планшете и маркировкой в качестве контроля.
- Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C для отверждения не менее чем на 1 час.
2. Строим сетку опорных точек и снимаем видео в каждой точке
- Перенесите планшет с образцом из инкубатора на предметный столик для микроскопа. Подождите 10 минут, чтобы образец выровнялся с комнатной температурой, если нагреваемый столик недоступен.
- Наблюдайте за образцом с помощью маломощных объективов, чтобы убедиться, что он цел и готов к визуализации. Определите положение опухоли в лунке.
- Решите, сколько точек отбора проб следует взять. Как правило, 20 точек отбора проб в каждой лунке, распределенных по концентрическим кольцам вокруг сфероида, дают достаточно подробные результаты.
- Переместите предметный столик в нужное положение и используйте программное обеспечение для сопряжения микроскопа для записи координат x и y (или запишите координаты вручную, если программное обеспечение для сопряжения недоступно).
- Переключите микроскоп на мощную линзу объектива (обычно 100X) и выберите подходящий куб фильтра для длины волны возбуждения трассирующих зондов. Используйте список точек, созданный на шаге 2.4, для перехода к первой точке на сетке.
- Отрегулируйте фокус, чтобы найти дно скважины, затем переместитесь вверх, чтобы найти поле зрения (fov), содержащее несколько фокусируемых трассирующих щупов.
- Наблюдайте за гистограммой интенсивности и регулируйте интенсивность и время экспозиции, чтобы обеспечить максимально возможный динамический диапазон, гарантируя, что изображение не станет насыщенным.
- Получите видеопоследовательность с частотой кадров 20–30 мс на кадр (рекомендуется приблизительно 800 кадров или продолжительностью 16–24 секунды, чтобы обеспечить достаточную статистику для надежного вычисления MSD, сбалансированную с необходимостью минимизации времени сбора данных в каждой точке пространственной сетки) и сохраните их с помощью соответствующего соглашения. Во время записи не прикасайтесь к микроскопу или столу.
- Повторите шаги с 2.6 по 2.9 для каждой точки отбора проб в сетке.
- Повторите шаги с 2.3 по 2.10 для каждой лунки в эксперименте.
