1. Подготовка клеточной культуры и экспериментальная установка
- Поддерживайте клетки рака толстой кишки человека, HCT-116 в соответствии с рекомендациями поставщика, в монослоях в колбахразмером 75 см 2 культуры, содержащих 10 мл препарата McCoy's 5a Medium Modified, дополненных 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% антимикотическим раствором антибиотика.
- Выращивайте клетки в увлажненной среде с 5% содержаниемCO2 при 37 °C до 70% конфлюенции с обновлением среды каждые 2–3 дня.
- Чтобы получить пучок БНЗТ (например, пучок нейтронов плюс бисфенол А) и эффект БНЗТ, убивающий раковые клетки в виде тяжелых частиц и отложить большую часть их энергии в борсодержащих раковых клетках, за день до облучения добавьте в среду для культивирования клеток агент доставки бора – например, 10БФА, 4-бороно-L-фенилаланин (10 мкг 10В/мл, 0,925 мМ конечно) за 12–16 ч (максимальное поглощение бора) до облучения.
заметка: При использовании другой клеточной линии, для которой нет данных в случае исследования БНЗТ, проверьте поглощение бора для каждой клеточной линии, чтобы получить оптимальную концентрацию бора. Измерьте поглощение BPA клетками с помощью оптической эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ICP-OES), выполненной группой Dagrosa.
- Через 12-16 часов после доставки бора аспирируйте среду и промойте клетки 10 мл 1x PBS. Затем трипсинизируйте клетки, добавив в клетки 2 мл раствора Trypsin-EDTA, и инкубируйте в течение 5 минут при 37 °C для усиления отслойки клеток. Когда клетки начнут отделяться, прекратите действие трипсина, добавив 10 мл полной среды.
- Аспирируйте клеточную суспензию в пробирке объемом 15 мл и подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток, добавив 10 мкл 0,4% трипанового синего на 10 мкл клеток, перемешайте и аликвотируя 10 мкл на предметном стекле. Разбавляют клеточную суспензию до концентрации 1 х 106 клеток/мл среды. Аликвота 1 мл клеточной суспензии на криопробирку.
- Подготовьте термолюминесцентные дозиметры (TLD) для измерения доз гамма-излучения и золотую фольгу для флюентов нейтронов и прикрепите TLD к криопробиркам или колбе для клеточных культур перед облучением.
- Облучайте 1 x 106 клеток/мл смешанным пучком нейтронов при рекомендуемом минимальном потоке тепловых нейтронов 5,9 x10 11 (н/см-2 мин-1)4 в колбах для культивирования или криопробирках в зависимости от возможностей установки><.
заметка: Установите время облучения перед получением рекомендуемого потока нейтронов.
- После облучения затравить 1 мл облученных клеток (1 х 106 клеток/мл) на покровные стекла 22 х 22 мм в чашки Петри 35 мм или 6-луночные планшеты, добавить 2 мл необходимой среды. Инкубируйте клетки не более 3 часов при 37 °C во влажной среде с содержаниемCO2 5%, чтобы они могли прикрепиться к покровным стеклам. Время от времени наблюдайте за прикреплением клеток под перевернутым микроскопом с 20-кратным объективом.
заметка: Для клеток HCT-116 минимальная плотность составляет 600 000 клеток для затравки. Для быстрой дальнейшей процедуры окрашивания используйте предметные стекла, соответственно уменьшите плотность клеток.
2. Фиксация клеток
- После облучения и инкубации клеток удалите среду из прикрепленных клеток и промойте клетки один раз 2,5 мл PBS.
- Зафиксируйте ячейки 1 мл 70% этанола на 10 мин при RT.
заметка: В качестве альтернативы используйте 1%-3,7% параформальдегид (PFA) для фиксации, как рекомендовано ранее. На этом протокол поставлен на паузу. Храните неподвижные клетки в этаноле в морозильной камере при температуре -20°C не более нескольких недель для дальнейшего анализа и иммунофлуоресцентного окрашивания.
3. Пермеабилизация клеток
- После фиксации удалите этанол из чашки Петри и промойте 2,5 мл 1x PBS.
заметка: Не допускайте высыхания клеток между этапами ополаскивания.
- Аккуратно добавьте 1 мл 0,2% Triton X-100/PBS, чтобы покрыть покровные листы с ячейками в чашках Петри.
- Инкубировать в течение 5 минут при RT.
- Промойте ячейки 3 раза 2,5 мл 1x PBS.
заметка: При необходимости увеличьте процент Triton X-100 в PBS до 0,5% (больше обнаруживаемых очагов, в зависимости от исследуемой клеточной линии). Выполняйте дополнительные стирки с PBST (PBS с 0,5% Tween), чтобы избежать неспецифического связывания.
- Заблокируйте стадию пермеабилизации 1 мл 2% БСА (Bovine Serum Fraction V альбумина), разведенного в PBS, и инкубируйте в течение минимум 30 мин или 1 ч с 1% БСА.
заметка: Этот этап может быть пропущен и зависит от типа используемого антитела. В качестве альтернативы используйте 5% FBS в соответствии с рекомендациями.
4. Иммунофлуоресцентное окрашивание
- Добавьте необходимое количество первичного антитела (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs и Anti-Rad52), разведенного в PBS, с BSA (2% альбумина V-фракции бычьей сыворотки) в соответствии с рекомендациями (см. Таблицу 1 с рекомендуемыми разведениями) (необходимо 100 мкл на образец).
| Первичное антитело | функция | Рекомендуемое разведение | Хранение [°C] |
| Анти-ɣ-H2AX | обнаружение ДНК-DSB | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Анти-ДНК-PKcs | обнаружение RIF белка DNA-PKcs, принадлежащего NHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Анти-RAD52 | обнаружение RIF белка Rad52, относящегося к HRR | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Вторичные антитела | | В неведении | |
| антимышиный IgG FITC | ɣ-H2AX фокусы | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| Козий антикролик IgG H&L (Alexa Fluor 488) | для очагов репарации белков NHEJ и HRR | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
Таблица 1: Рекомендуемые разведения и примечания по использованию антител, используемых в разделе
- Накройте чашку Петри для поддержания влажности в пластиковой коробке с увлажненным лигнином с использованием дистиллированной воды и выдерживайте в инкубаторе 30 минут при температуре 37 °C.
заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь. Инкубацию можно проводить при температуре 4 °C в течение ночи.
- После инкубации выполните 3 промывки 2,5 мл PBS.
заметка: Не допускайте высыхания предметного стекла во время полоскания.
- Добавьте необходимое количество вторичного антитела (против мышиного IgG FITC, козьего антикролика IgG (Alexa Fluor 488), разведенного в PBS с BSA (см. Таблицу 1) (необходимо 100 μL на образец). Для выполнения этого и последующих шагов работайте в темное время суток.
- Снова накройте чашку Петри для поддержания влажности в пластиковой коробке с увлажненным лигнином и инкубируйте в инкубаторе не менее 30 минут при температуре 37 °C.
- После инкубации выполните 3 промывки 2,5 мл PBS.
- Добавьте 100 мкл DAPI, разведенного в PBS, до конечной концентрации 1 мкг/мл для уравновешивания ядер.
- Инкубируйте в течение короткого времени максимум 2 минуты при RT.
- После инкубации выполните 3 промывки 2,5 мл PBS.
- Снимите ПБС и аккуратно наденьте покровное стекло на верхнюю часть монтажного материала, не допуская образования пузырьков воздуха, и заклейте края покровного стекла лаком для ногтей. Подождите, пока лак высохнет и покрасьте покровное стекло вокруг.
- Дождитесь затвердевания монтажного носителя (до 3 ч) перед анализом изображения под флуоресцентной микроскопией.
заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь. Храните стеклянные предметные стекла в пластиковой коробке при температуре 4 °C в темноте.
