1. Посев клеток
- Засейте 2 x 105 клеток колоректального рака HCT116 в лунку в 24-луночный планшет и поддерживайте клетки в модифицированной среде Dulbecco Eagle (DMEM) в течение ночи при температуре 37 °C.
- Замените питательную среду средой, содержащей 100 мкМ сульфат железа (ФС) или 10 мкМ доксорубицин (ДОКС), или без таковой и инкубируйте в течение 24 ч.
2. Подготовка решения DCFH-DA
- Растворите 4,85 мг DCFH-DA в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) до получения 10 мМ исходного раствора.
- Разбавить исходный раствор предварительно подогретым DMEM в рабочий раствор с концентрацией 10 мкМ непосредственно перед добавлением в лунки.
- Вихревой рабочий раствор в течение 10 с.
3. Окрашивание DCFH-DA
- Удалите содержащую препарат среду и умойтесь один раз DMEM.
- Добавьте 500 μL рабочего раствора DCFH-DA в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
- Снимите рабочий раствор DCFH-DA. Умойтесь один раз с DMEM и 2x с 1x фосфатно-солевым буфером (PBS).
- Добавьте 500 мкл 1x PBS в каждую лунку.
4. Получение изображений и измерение интенсивности
- Сделайте репрезентативные флуоресцентные изображения для каждой лунки с помощью канала зеленого флуоресцентного белка (GFP) на флуоресцентном микроскопе.
- После получения изображений удалите PBS и добавьте 200 мкл буфера для радиоиммунопреципитации (RIPA) в каждую лунку.
- Инкубировать на льду в течение 5 минут, затем собрать лизат клеток в пробирки объемом 1,5 мл.
- Центрифуга при 21 130 x g в течение 10 мин при 4 °C.
- Перенесите 100 мкл надосадочной жидкости на черный 96-луночный планшет и измерьте интенсивность флуоресценции с помощью флуоресцентного микропланшетного ридера с длиной волны возбуждения 485 нм и длиной волны излучения 530 нм.
- Перенесите 1 мкл надосадочной жидкости в прозрачный 96-луночный планшет, содержащий 100 мкл 1x раствора для анализа белка, чтобы измерить концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
- Нормализуйте интенсивность флуоресценции с концентрацией белка.
