$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Культивирование клеточных линий
- Выращивайте HK-клетки в полной среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 нМ глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина G и 100 мг/мл стрептомицина при 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием ><CO2.
заметка: HK-клетки являются нормальными фолликулярными дендритными клетками человека и могут быть выращены и расширены в течение ≤ 15 пассажей in vitro.
2. Мечение и обогащение опухолей, меченных люциферазой
- Имплантация опухолей непосредственно в левый и правый фланг 6-8-недельных самок мышей NOD/SCID.
- Измеряйте рост опухоли раз в две недели с помощью цифрового штангенциркуля.
- При 1 см в диаметре трансдуцируйте опухоль. Непосредственно введите в опухоль однократную дозу Luc/красного флуоресцентного белка (RFP)-лентивируса (50 мкл/опухоль, разведение 1:30 из концентрированного запаса лентивируса с высоким титром) с помощью шприца объемом 1 куб. см с иглой 27 G.
заметка: Опухоль пациента обычно достигает 1 см в диаметре за 1-2 месяца. Тем не менее, скорость роста чрезвычайно варьирует и зависит от ряда факторов, включая степень и тип опухоли.
3. Модель мыши CRC
- Обезболите самца мыши с NOD/SCID в возрасте от шести до восьми недель изофлураном (2,5% в 100% кислороде, 1 л/мин) в индукционной камере. Подтвердите седативный эффект щипком на пальце ноги.
- Поместите мышь, находящуюся под наркозом, в положение лежа на спине под препарирующим микроскопом, прикрепив ее морду к носовому конусу изофлурана, а передние конечности - с помощью ленты для устойчивости><.
заметка: Лупы можно использовать вместо препарирующего микроскопа. Небольшой предмет может быть использован для улучшения видимости и угла наклона, когда его помещают под основание хвоста, поднимая анальное отверстие. Как правило, небольшие участки марли сворачивают в форму цилиндра диаметром 1 дюйм.
- Расширяйте анальный канал изогнутыми смазанными щипцами с тупыми наконечниками, чтобы обнажить дистальные отделы анального канала и слизистую оболочку прямой кишки. Удалите каловые массы.
- С помощью стерильной съемной иглы 30 г на стеклянном шприце объемом 50 мкл введите 10 мкл меченых люциферазой опухолевых клеток и HK-клеток (ресуспендируйте 10 мкл опухолевых клеток на мышь для модели КРР в полной среде RPMI) в дистальный задний подслизистый слой прямой кишки, на 1–2 мм выше анального канала. Скос иглы должен быть покрыт слизистой оболочкой. Будьте осторожны, чтобы не попасть в полость малого таза.
- Извлеките мышь из носового конуса изофлурана. Наблюдайте за ним в течение 1 часа после процедуры. Ищите признаки дистресса, например, сгорбленную спину, затрудненное дыхание и т.д.
4. Биолюминесцентная визуализация
- Еженедельно контролируйте первичную метастатическую нагрузку опухоли, печени и легких с помощью биолюминесцентной системы визуализации для определения активности люциферазы.
- Получите эксперимент с CRC у мышей и взвесьте. Введите 150 мг/кг люциферина внутрибрюшинно и подождите 5 минут, пока субстрат начнет циркулировать в теле мыши.
- Обезболить мышь 2,5% изофлураном в 100% кислороде, 1 л/мин в индукционной камере.
- Поместите мышь в аппарат визуализации BLI так, чтобы носик был зафиксирован в носовом конусе. При экспонировании для изображения убедитесь, что область интереса обращена к камере. Для инъекции CRC брюшная сторона должна быть обращена к камере для каждого изображения. Представьте мышь в положении лежа на спине.