$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление huA33-TCO
ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее сообщалось о синтезе huA33-TCO. Тем не менее, для удобства читателя, он воспроизведен здесь с поправками на оптимальные условия.
- В микроцентрифужной пробирке объемом 1,7 мл приготовьте 125 мкл раствора (E)-циклоокт-4-енил2,5-диоксо-1-пирролидинилкарбоната (TCO-NHS) в сухом диметилформамиде (DMF) в концентрации 40 мг/мл (0,15 М). Этот раствор может быть аликвотирован и заморожен при -80 °C для использования в будущих экспериментах.
- В отдельной микроцентрифужной пробирке объемом 1,7 мл приготовьте раствор huA33 в дозе 5 мг/мл в 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS; 2,7 мМ хлорида калия, 137 мМ хлорида натрия и 11,9 мМ фосфата калия, pH 7,4).
- Используя малые аликвоты (<5 μл) 0,1 М Na2CO3, отрегулируйте pH раствора антитела от Шага 1,2 до 8,8-9,0. Используйте бумагу для измерения pH или рН-метр с микроэлектродом для контроля рН и следите за тем, чтобы рН не превышал 9,0.
- К раствору антитела, описанному в шаге 1.3, медленно добавляют объем, соответствующий 40 молярным эквивалентам TCO-NHS по отношению к количеству антитела. Например, если в растворе содержится 5 мг (30 нмоль) huA33, добавьте 9,0 мкл (1,20 мкмоль) из 40 мг/мл (0,15 М) раствора TCO-NHS.
заметка: TCO-NHS является гидрофобной. При добавлении его в раствор антитела добавляйте медленно и с перемешиванием, чтобы не допустить выпадения осадка. Не превышайте 10% DMF по объему в конечном реакционном растворе.
- Дайте реакции инкубироваться при 25 °C на термомиксере в течение 1 ч при слабом перемешивании (500 об/мин).
- Через 1 ч очистите иммуноконъюгат huA33-TCO с помощью предварительно упакованной одноразовой обессоливающей колонки для исключения размера.
- Уравновесьте столбец исключения размера в соответствии с описанием поставщика, чтобы удалить все консерванты, присутствующие в столбце во время хранения. Типичная процедура предполагает промывку колонки 5 раз объемом PBS, который соответствует объему колонки: 5 x 2,5 мл PBS.
- Добавьте реакционную смесь в столбец исключения размера, отметив объем реакционной смеси.
- После того, как реакционная смесь поступила в колонку, добавьте соответствующее количество PBS, чтобы довести общий объем раствора, добавляемого в колонку, до 2,5 мл. Например, если в результате реакции конъюгации общий объем составил 1,3 мл, добавьте в колонку 1,2 мл дополнительного PBS.
- Соберите продукт, используя 2 мл PBS в качестве элюента.
заметка: На этом этапе будет получена окончательная конструкция huA33-TCO в 2 мл PBS, pH 7,4.
- Измерьте концентрацию huA33-TCO с помощью УФ-ВИД спектрофотометра, контролирующего длину волны 280 нм. Молярный коэффициент экстинкции для большинства IgG (ε280) составляет 210 000 М-1 см-1.
- Если требуется раствор с более высокой концентрацией иммуноконъюгата, сконцентрируйте раствор huA33-TCO с помощью центробежной фильтрующей установки с отсечкой 50 000 молекулярной массы в соответствии с инструкциями производителя.
заметка: Известно, что многие антитела агрегируются или выпадают в осадок во время концентрации. При попытке провести эту процедуру с новым антителом исследователи должны полагаться на литературу или свой собственный опыт работы с рассматриваемым антителом.
- Готовый иммуноконъюгат huA33-TCO храните при температуре 4 °C в темноте, если это необходимо немедленно. Если его планируется использовать более 4 дней в будущем, храните его при температуре -80 °C в темноте.
заметка: Это приемлемая точка остановки в процедуре. Готовый иммуноконъюгат huA33-TCO должен быть стабильным в течение не менее 6 месяцев при температуре -80 °C в темноте.
2. Синтез Tz-PEG 7-NHBoc
- В микроцентрифужной пробирке объемом 1,7 мл растворите 5 мг тетразина N-гидроксисукцинимидилового эфира (Tz-NHS; 12,6 мкмоль) в 0,15 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО).
- В отдельной микроцентрифужной пробирке объемом 1,7 мл растворите 8 мг защищенного Boc амино-ПЭГ-полимера, O-(2-аминоэтил)-O'-[2-(Boc-амино)этил]гексаэтиленгликоль (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 мкмоль) в 0,15 мл безводного ДМСО.
- В раствор Tz-NHS добавить 3 мкл (21,3 мкмоль, 1,7 молярного эквивалента) триэтиламина (TEA) и тщательно перемешать.
- Добавьте раствор розового тетразина в раствор NHBoc-PEG7-NH 2 из этапа 2.2 и инкубируйте реакционную смесь в течение 30 минут при комнатной температуре (RT) с легким перемешиванием.
- Через 30 минут разбавьте реакционную смесь в соотношении 1:1 в H2O и очистите ее с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обратной фазой C18, чтобы отделить любой непрореагировавший Tz-NHS от Tz-PEG 7-NHBoc. Используйте растворители без кислоты, чтобы предотвратить преждевременное удаление защитной группы Boc. Контролируйте Tz-PEG 7-NHBoc и Tz-NHS на длине волны 525 нм.<бр/>
заметка: Время удержания в значительной степени зависит от оборудования ВЭЖХ в каждой лаборатории (насосы, колонны, трубки и т. д.), и перед очисткой должен быть проведен соответствующий контроль. Однако, в качестве примера, если использовать градиент от 5:95 MeCN/H2O (оба без какой-либо добавки) до 95:5 MeCN/H2O в течение 30 минут, расход 1 мл/мин и аналитическую колонку C18 размером 4,6 мм x 250 мм, то время удержания Tz-NHS и Tz-PEG 7-NHBoc составляет около 16 минут и 18 минут. соответственно.
- Заморозьте собранный элюент ВЭЖХ с помощью жидкого азота и оберните замороженную пробирку для сбора алюминиевой фольгой. Поместите замороженную пробирку для сбора на лиофилизатор на ночь, чтобы удалить подвижную фазу ВЭЖХ. Изделие будет характерного ярко-розового твердого цвета.<бр/>
заметка: Если жидкий азот недоступен, заморозьте собранный элюент ВЭЖХ в сухом льду или на ночь в морозильной камере при температуре -80 °C.
3. Синтез Tz-PEG7-NH 2
- К продукту из Шага 2.6, Tz-PEG 7-NHBoc, добавьте 1,5 мл дихлорметана (DCM) и переложите этот раствор в небольшую колбу с круглым дном.
- Добавьте 0,25 мл трифторуксусной кислоты (ТЖК) по каплям в розовый раствор из Шага 3.1.
- Дайте реакции инкубироваться в течение 30 минут при RT с легким перемешиванием.
- Через 30 минут испарить растворитель с помощью ротационного выпаривания. Не превышайте температуру водяной бани 37 °C.
- Восстановите розовый вязкий продукт в 0,5 мл воды.
- Очистите продукт с помощью ВЭЖХ с обратной фазой C18, чтобы отделить Tz-PEG7-NH 2 от предшественника, защищенного Boc. Контролируйте Tz-PEG 7-NHBoc и Tz-PEG7-NH 2 на длине волны 525 нм.<бр/>
заметка: Время удержания в значительной степени зависит от оборудования ВЭЖХ в каждой лаборатории (насосы, колонны, трубки и т. д.), и перед очисткой должен быть проведен соответствующий контроль. Однако, в качестве примера, если использовать градиент от 5:95 MeCN/H2O (оба с 0,1% TFA) до 95:5 MeCN/H2O в течение 30 минут, расход 1 мл/мин и аналитическую колонку C18 размером 4,6 мм x 250 мм, то время удержания Tz-PEG 7-NHBoc и Tz-PEG7-NH 2 составляет около 18 мин и 13 мин. соответственно.
- Заморозьте собранный элюент ВЭЖХ с помощью жидкого азота и оберните замороженную пробирку для сбора алюминиевой фольгой. Поместите замороженную пробирку для сбора на лиофилизатор на ночь, чтобы удалить подвижную фазу ВЭЖХ. Изделие будет иметь ярко-розовое твердое вещество.
- Восстановите продукт из Стадии 3.7, Tz-PEG7-NH 2, со 150 мкл ДМСО и перенесите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл.
- Измерьте концентрацию Tz-PEG7-NH 2 с помощью УФ-ВИД спектрофотометра, контролирующего длину волны 525 нм. Коэффициент угасания моляров для Tz-PEG 7-NH2 (ε525) составляет 535 М-1 см-1.
4. Синтез Tz-PEG7-DOTA
- Растворите Tz-PEG7-NH 2 (4,5 мг, 6,9 мкмоль) в 0,15 мл ДМСО (или продолжайте использовать раствор, полученный на этапе 3.8).
- Добавьте 22 молярных эквивалента TEA (21 μL, 0,15 ммоль) в раствор, содержащий тетразин, начиная с Шага 4.1.
- Добавьте 10 мг (14,2 мкмоль) p-SCN-Bn-DOTA в виде твердого вещества и делайте раствор вихревым в течение примерно 2 мин или до полного растворения материала.
- Дайте реакции инкубироваться в течение 30 минут при RT с легким перемешиванием.
- Через 30 минут разбавьте реакцию 1:1 в H2O и очистите продукт с помощью ВЭЖХ с обратной фазой C18 для удаления непрореагировавшего p-SCN-Bn-DOTA. p-SCN-Bn-DOTA может контролироваться на длине волны 254 нм, в то время как Tz-PEG7-DOTA лучше всего контролируется на длине волны 525 нм.
заметка: Очевидно, что время удержания в значительной степени зависит от оборудования ВЭЖХ в каждой лаборатории (насосы, колонны, трубки и т. д.), и перед очисткой следует проводить соответствующие проверки. Однако, в качестве примера, если использовать градиент от 5:95 MeCN/H2O (оба с 0,1% TFA) до 95:5 MeCN/H2O в течение 30 минут и аналитическую колонку C18 размером 4,6 x 250 мм, то Tz-PEG7-DOTA и p-SCN-Bn-DOTA имеют время удержания около 15,6 мин и 16,1 мин соответственно.
- Заморозьте собранный элюент ВЭЖХ с помощью жидкого азота и оберните замороженную пробирку для сбора алюминиевой фольгой. Поместите замороженную пробирку для сбора на лиофилизатор на ночь, чтобы удалить подвижную фазу ВЭЖХ. Изделие будет представлять собой ярко-розовую пудру.
- Восстановите продукт в 0,15 мл ДМСО и измерьте концентрацию с помощью УФ-ВИД спектрофотометра, контролирующего длину волны 525 нм. Коэффициент затухания моляров для Tz-PEG7-DOTA (ε525) составляет 535 М-1 см-1.
- Проанализируйте конечное соединение с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии высокого разрешения (HRMS), чтобы убедиться в успешности синтеза. В таблице 1 приведены экспериментально определенные химические сдвиги и молекулярные массы всех соединений, обсуждаемых в данной работе.
- Храните очищенный раствор Tz-PEG7-DOTA в темноте при температуре -80 °C.
заметка: Это приемлемая точка остановки в процедуре. Готовый предшественник Tz-PEG7-DOTA стабилен в течение как минимум 1 года в этих условиях.
5. 177Lu Радиомечение Tz-PEG7-DOTA
ВНИМАНИЕ: Этот шаг протокола включает в себя обработку и манипулирование радиоактивностью. Прежде чем выполнять эти шаги или выполнять любую другую работу с радиоактивностью, исследователи должны проконсультироваться с отделом радиационной безопасности своего учреждения. Примите все возможные меры, чтобы свести к минимуму воздействие ионизирующего излучения.
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с небольшими количествами радиометаллов рекомендуется, чтобы все буферы были свободны от следов металлов, чтобы предотвратить помехи при связывании сайтов координации.
- В центрифужную пробирку объемом 1,7 мл добавьте 200 мкл 0,25 М ацетата аммония, отрегулированного аликвотами 1 М HCl до pH 5,5,
заметка: При использовании для мечения менее 370 МБк активности, объем используемого буфера следует уменьшить до 100 мкл.
- Добавьте нужное количество [177Lu]LuCl3 в буферный раствор. Добавленное количество будет зависеть от количества испытуемых в эксперименте и вводимых радиоактивных доз. Рекомендуется добавить 1-2 дополнительные дозы радиоактивности в качестве меры предосторожности, чтобы компенсировать потенциальную потерю радиоактивности во время этапов очистки.
- Добавьте Tz-PEG7-DOTA в ДМСО в радиоактивную смесь на Шаге 5.2. Количество Tz-PEG7-DOTA зависит от количества тестируемых испытуемых. Более подробно с этой темой можно ознакомиться в Шаге 6.2.2.2.
- Дайте раствору инкубироваться при температуре 37 °C в течение 20 минут.
- Убедитесь, что радиоактивное мечение завершено, с помощью радиомгновенной тонкослойной хроматографии (радио-iTLC) с 50 мМ ЭДТА, pH 5,5 в качестве подвижной фазы. Меченый [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz останется на исходном уровне — Rf = 0 — в то время как свободный [177Lu]Lu3+ будет координироваться ЭДТА и будет перемещаться вместе с фронтом растворителя, Rf = 1.0 (рис. 1B).
- Если количественное мечение не достигнуто, добавьте лиганды для координации свободного радиометалла. В качестве альтернативы очистите маркированный [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz с помощью картриджа C18. Следуйте инструкциям производителя по применению. Пример процедуры приведен ниже.
- Подготовьте картридж, медленно пропустив 5 мл этанола через картридж с помощью большого шприца. Затем пропустите 5 мл ацетонитрила, а затем 5 мл деионизированного (DI) H2O.
- Наберите раствор радиолиганда из Шага 5.3 в шприц меньшего размера и медленно введите его в картридж C18. Затем промойте картридж 10 мл DI H2O, чтобы удалить все несвязанные [177Lu]LuCl3.
- Разбавьте 500 μл этанола. Удалите весь этанол из конечного продукта, пропустив по сосуду с низкой скоростью потока сухой азот или аргон в течение 10-15 минут. Затем ресуспендируют радиолиганд в физиологическом растворе в объеме, определенном на Шаге 6.2.2.2.
6. Исследования in vivo
ВНИМАНИЕ: Как и в разделе 5, этот шаг протокола включает в себя обработку и манипулирование радиоактивностью. Прежде чем выполнять эти шаги, исследователи должны проконсультироваться с отделом радиационной безопасности своего учреждения. Примите все возможные меры, чтобы свести к минимуму воздействие ионизирующего излучения.
- Подготовка животных
- Самкам атимических голых мышей подкожно имплантируйте 5 x 106 клеток колоректального рака SW1222, суспензированных в 150 мкл смеси клеточной среды и матрикса в соотношении 1:1 (например, Матригель), и дайте им вырасти в ксенотрансплантат размером 100-150 мм3 (через 14-18 дней после инокуляции).
- Сортировка животных для эксперимента по биораспределению
- Как только опухоли достигнут достаточного размера, определенного с помощью штангенциркуля, отсортируйте животных, чтобы убедиться, что каждая когорта имеет примерно одинаковый средний объем опухоли. Животных можно отличить в каждой клетке по отметинам на хвосте несмываемыми чернилами (одна полоса, две полосы и т.д.).
- Сортировка животных для исследования методом лонгитюдной терапии
- Как только опухоли достигнут достаточного размера, определенного с помощью штангенциркуля, прикрепите ушные бирки к каждому из животных, чтобы обеспечить правильное отслеживание на протяжении всего эксперимента><.
заметка: Цифровые ушные бирки могут отваливаться на протяжении всего эксперимента. В связи с этим рекомендуется систематически сопровождать эти физические метки ушными насечками (т.е. правые, левые, двусторонние, правые x 2, левые x 2).
- Отсортируйте животных так, чтобы средний объем опухоли в каждой когорте был примерно одинаковым. Следующий метод сортировки животных может быть выполнен с помощью программы для работы с электронными таблицами.
- Перечислите идентификационные номера животных, рисунок ушной выемки и объем опухоли в трех отдельных столбцах.
- Отсортируйте данные от наименьшего к наибольшему объему опухоли.
- В четвертом столбце присвойте каждому животному номер клетки и циклически пройдитесь по клеткам змеиным образом. Например, если есть 5 клеток, этот столбец будет заполняться «5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5...» до тех пор, пока всем животным не будет назначена клетка.
- После того, как клетки назначены, отсортируйте данные по номеру клетки. Если используются ушные насечки, убедитесь, что каждое животное в данной клетке имеет уникальный рисунок ушных выемок. Если в одной клетке дублируются (две или более одинаковых мышей), поменяйте одну мышь на одну из другой клетки с отсутствующим рисунком, пока в каждой клетке не появятся животные с уникальными узорами ушных выемок.
- Рецептуры и инъекции
заметка: Последовательность инъекций как для биораспределения, так и для терапевтического исследования выглядит следующим образом: сначала вводится huA33-TCO, а затем [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz через заранее определенный интервал.
- Иммуноконъюгат
- Разбавьте аликвоту раствора huA33-TCO на стадии 1,9 до концентрации 0,8 мг/мл в 0,9% стерильном физиологическом растворе.
- Наберите дозы 150 мкл (100 мкг) раствора huA33-TCO в шприцы, предварительно обработанные 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS и храните эти шприцы на льду><.
заметка: Лечение БСА снижает неспецифическое связывание антитела со стенками шприца.
- Прогрейте животное под тепловой лампой в течение 3 минут, чтобы расширить хвостовую вену.
- Введите раствор huA33-TCO в хвостовую вену мыши, несущей ксенотрансплантат. Подождите 24 часа (или другой заранее определенный интервал времени), чтобы huA33-TCO накопился в опухоли мыши.
- Радиолиганд
- Радиометка Tz-PEG7-DOTA, как описано в разделе 5.
- Дозы в 150 мкл 0,9% стерильного физиологического раствора, содержащего 1,1 молярного эквивалента Tz-PEG 7-DOTA по отношению к количеству введенного huA33-TCO. Например, если животному вводили 100 мкг (0,67 нмоль) huA33-TCO и получали реакционную смесь [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz со специфической активностью 12,4 ГБк/мкмоль, то будут подбирать дозы, содержащие 9,14 МБк активности каждая. Это соответствует 0,74 нмоль Tz (1,1 молярного экв. относительно huA33-TCO).
- Прогрейте животных под тепловой лампой в течение 3 минут, чтобы расширить хвостовую вену.
- Введите дозу радиолиганда в хвостовую вену мыши, несущей ксенотрансплантат. Объем вводимой активности определяется исследователем. Опубликованные данные показали дозозависимое терапевтическое влияние на размер опухоли в диапазоне от 7,4 до 55,5 МБк.
