Циркулирующая экстракция микроРНК: метод выделения микроРНК из образцов плазмы с помощью органической экстракции и обогащения малых РНК

Abstract

Источник: Canale, M. et al., Обнаружение специальной панели циркулирующей микроРНК у пациентов с метастатическим колоректальным раком. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео описывается экстракция циркулирующей микроРНК из образцов плазмы пациентов с колоректальным раком с помощью органической экстракции с последующим обогащением стекловолоконной колонкой. МикроРНК стабильны в биологических жидкостях, таких как сыворотка и плазма, что делает их идеальными циркулирующими биомаркерами для диагностики рака, прогноза, принятия решений и мониторинга лечения. Этот метод поможет выявить новые циркулирующие биомаркеры, способные прогнозировать клинические исходы у пациентов.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги в стерилизованном вытяжном шкафу в соответствии с надлежащей лабораторной практикой (GLP).

1. Сбор и хранение плазмы

1. Соберите 3 мл образца периферической крови в пробирку K3E EDTA.
2. Центрифугируйте пробирку при комнатной температуре 1 880 x g в течение 15 мин.
3. Восстановите надосадочную плазму в аликвотах по 450 μл.
4. Храните образцы при температуре -80 °C до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте пробирку периферической крови в течение 2 часов после сбора. При извлечении плазмы из трубки не следует нарушать лимфоцитарный слой.

2. Экстракция циркулирующих микроРНК из образцов плазмы

1. Приготовьте все необходимые растворы и разморозьте образцы для этапов экстракции.
   1. Добавьте 375 мкл 2-меркаптоэтанола в 2-кратный денатурирующий раствор и хорошо перемешайте.
   2. Добавьте 21 мл 100% этанола класса ACS в раствор для промывки микроРНК I и хорошо перемешайте.
   3. Добавьте в раствор для стирки 40 мл 100% этанола марки ACS 2/3 и хорошо перемешайте.
   4. Дайте аликвоте плазмы оттаять при комнатной температуре, а затем начните этапы экстракции.

2. Органическая экстракция
   1. Перенесите 400 мкл образца плазмы в пробирку объемом 2 мл без РНКазы.
   2. Добавьте 400 мкл 2-кратного денатурирующего раствора, перемешайте с помощью вортекса и кратковременно центрифугируйте.
   3. Добавьте 4 мкл 1 нМ спайка, перемешайте с помощью вортекса и кратковременно центрифугируйте.
   4. Добавьте 800 мкл кислотного фенол-хлороформа.
   5. Вихрь в течение 60 с и центрифуга на максимальной скорости (≥10 000 x g) в течение 15 минут.
   6. Переложите верхнюю водную фазу в свежую пробирку. Не нарушайте работу интерфазы. Обратите внимание на восстановленный объем и выбросьте пробирку, содержащую неводную фазу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор 2x денатурации хранится при температуре 4 °C и может затвердевать при этой температуре. Перед применением раствор подогреть до 37 °С, периодически помешивая в течение 10-15 минут. Будьте осторожны, чтобы удалить нижнюю фазу, содержащую кислотный фенол-хлороформ, а не водный буфер, который лежит поверх смеси. Нагрейте элюирующий раствор или воду без нуклеаз до 95 °C. Будьте осторожны, чтобы нагреть достаточный объем раствора (100 мкл на образец + 10% избытка).

3. Обогащение малой РНК
   1. Добавьте 1/3 объема этанола 100% в водную фазу с шага 2.2.6 и тщательно перемешайте.
   2. Поместите картридж фильтра в новую пробирку для сбора каждого образца.
   3. Перенесите до 700 мкл лизата с шага 2.3.1 и этанол в фильтрующий картридж и центрифугу при давлении 10 000 x g в течение 30 с.
   4. Если осталось >700 мкл смеси, поместите фильтрат в свежую пробирку и повторите шаг 2.3.3; Повторяйте до тех пор, пока вся смесь не пройдет через фильтрующий картридж.
   5. Измерьте общий объем проточного потока.
   6. Добавьте 2/3 объема этанола 100% в фильтрат и тщательно перемешайте.
   7. Поместите второй фильтрующий картридж в свежую сборную пробирку.
   8. Перенесите до 700 мкл объема образца в картридж и центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 30 с. Откажитесь от проточного потока.
   9. Повторяйте шаг 1.3.8 до тех пор, пока вся смесь не пройдет через фильтрующий элемент.
   10. Нанесите 700 мкл раствора для промывки микроРНК 1 на фильтрующий картридж и центрифугируйте фильтрующий элемент с помощью сборной трубки при давлении 10 000 x g в течение 15 с. Откажитесь от проточного потока. Поместите фильтрующий картридж в ту же сборную трубку.
   11. Нанесите 500 μL моющего раствора 2/3 на фильтрующий картридж и центрифугируйте фильтрующий картридж со сборной трубкой при давлении 10 000 x g в течение 15 с. Откажитесь от проточного потока. Поместите картридж фильтра в свежую сборную трубку.
   12. Поместите картридж фильтра в свежую сборную пробирку и повторите шаг 2.3.11 с 500 мкл моющего раствора 2/3. Выбросьте проточный канал и переложите картридж фильтра в свежую сборную трубку.
   13. Центрифугируйте пробирки с фильтрующими элементами при давлении 10 000 x g в течение 1 мин.
   14. Переложите картридж фильтра в свежую сборную пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 100 мкл предварительно нагретого (95 °C) элюирующего раствора или воды, не содержащей нуклеаз.
   15. Центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 30 с для восстановления микроРНК и хранения при -80 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В растворе для стирки может образоваться белый осадок на 2/3. Этот осадок представляет собой избыток ЭДТА, выделяемый из раствора. Избегайте вытягивания этих кристаллов на этапах пипетирования.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Безрназные пробирки Safe-lock 1,5 мл	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free 1000 &микро; L советы	Starlab	S1122-1830
Безрназный сейф-замок 2 мл пробирки	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 &микро; L советы	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 &; L советы	Starlab	S1120-8810
mirVana PARIS РНК и набор для очистки нативного белка	Thermo Fisher	AM1556
100% этанол и класс ACS	Реагенты Carlo Erba	414605
2-меркапто-этанол	Sigma-Aldrich	M3148
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 &m; L лабораторные пипетки Вытяжной
шкаф
Настольные микроцентрифуги
вихрь