Циркулирующая экстракция микроРНК: метод выделения микроРНК из образцов плазмы с помощью органической экстракции и обогащения малых РНК

Аннотация

Источник: Canale, M. et al., Обнаружение специальной панели циркулирующей микроРНК у пациентов с метастатическим колоректальным раком. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео описывается экстракция циркулирующей микроРНК из образцов плазмы пациентов с колоректальным раком с помощью органической экстракции с последующим обогащением стекловолоконной колонкой. МикроРНК стабильны в биологических жидкостях, таких как сыворотка и плазма, что делает их идеальными циркулирующими биомаркерами для диагностики рака, прогноза, принятия решений и мониторинга лечения. Этот метод поможет выявить новые циркулирующие биомаркеры, способные прогнозировать клинические исходы у пациентов.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги в стерилизованном вытяжном шкафу в соответствии с надлежащей лабораторной практикой (GLP).

1. Сбор и хранение плазмы

1. Соберите 3 мл образца периферической крови в пробирку K3E EDTA.
2. Центрифугируйте пробирку при комнатной температуре 1 880 x g в течение 15 мин.
3. Восстановите надосадочную плазму в аликвотах по 450 μл.
4. Храните образцы при температуре -80 °C до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте пробирку периферической крови в течение 2 часов после сбора. При извлечении плазмы из трубки не следует нарушать лимфоцитарный слой.

2. Экстракция циркулирующих микроРНК из образцов плазмы

1. Приготовьте все необходимые растворы и разморозьте образцы для этапов экстракции.
   1. Добавьте 375 мкл 2-меркаптоэтанола в 2-кратный денатурирующий раствор и хорошо перемешайте.
   2. Добавьте 21 мл 100% этанола класса ACS в раствор для промывки микроРНК I и хорошо перемешайте.
   3. Добавьте в раствор для стирки 40 мл 100% этанола марки ACS 2/3 и хорошо перемешайте.
   4. Дайте аликвоте плазмы оттаять при комнатной температуре, а затем начните этапы экстракции.

2. Органическая экстракция
   1. Перенесите 400 мкл образца плазмы в пробирку объемом 2 мл без РНКазы.
   2. Добавьте 400 мкл 2-кратного денатурирующего раствора, перемешайте с помощью вортекса и кратковременно центрифугируйте.
   3. Добавьте 4 мкл 1 нМ спайка, перемешайте с помощью вортекса и кратковременно центрифугируйте.
   4. Добавьте 800 мкл кислотного фенол-хлороформа.
   5. Вихрь в течение 60 с и центрифуга на максимальной скорости (≥10 000 x g) в течение 15 минут.
   6. Переложите верхнюю водную фазу в свежую пробирку. Не нарушайте работу интерфазы. Обратите внимание на восстановленный объем и выбросьте пробирку, содержащую неводную фазу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор 2x денатурации хранится при температуре 4 °C и может затвердевать при этой температуре. Перед применением раствор подогреть до 37 °С, периодически помешивая в течение 10-15 минут. Будьте осторожны, чтобы удалить нижнюю фазу, содержащую кислотный фенол-хлороформ, а не водный буфер, который лежит поверх смеси. Нагрейте элюирующий раствор или воду без нуклеаз до 95 °C. Будьте осторожны, чтобы нагреть достаточный объем раствора (100 мкл на образец + 10% избытка).

3. Обогащение малой РНК
   1. Добавьте 1/3 объема этанола 100% в водную фазу с шага 2.2.6 и тщательно перемешайте.
   2. Поместите картридж фильтра в новую пробирку для сбора каждого образца.
   3. Перенесите до 700 мкл лизата с шага 2.3.1 и этанол в фильтрующий картридж и центрифугу при давлении 10 000 x g в течение 30 с.
   4. Если осталось >700 мкл смеси, поместите фильтрат в свежую пробирку и повторите шаг 2.3.3; Повторяйте до тех пор, пока вся смесь не пройдет через фильтрующий картридж.
   5. Измерьте общий объем проточного потока.
   6. Добавьте 2/3 объема этанола 100% в фильтрат и тщательно перемешайте.
   7. Поместите второй фильтрующий картридж в свежую сборную пробирку.
   8. Перенесите до 700 мкл объема образца в картридж и центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 30 с. Откажитесь от проточного потока.
   9. Повторяйте шаг 1.3.8 до тех пор, пока вся смесь не пройдет через фильтрующий элемент.
   10. Нанесите 700 мкл раствора для промывки микроРНК 1 на фильтрующий картридж и центрифугируйте фильтрующий элемент с помощью сборной трубки при давлении 10 000 x g в течение 15 с. Откажитесь от проточного потока. Поместите фильтрующий картридж в ту же сборную трубку.
   11. Нанесите 500 μL моющего раствора 2/3 на фильтрующий картридж и центрифугируйте фильтрующий картридж со сборной трубкой при давлении 10 000 x g в течение 15 с. Откажитесь от проточного потока. Поместите картридж фильтра в свежую сборную трубку.
   12. Поместите картридж фильтра в свежую сборную пробирку и повторите шаг 2.3.11 с 500 мкл моющего раствора 2/3. Выбросьте проточный канал и переложите картридж фильтра в свежую сборную трубку.
   13. Центрифугируйте пробирки с фильтрующими элементами при давлении 10 000 x g в течение 1 мин.
   14. Переложите картридж фильтра в свежую сборную пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 100 мкл предварительно нагретого (95 °C) элюирующего раствора или воды, не содержащей нуклеаз.
   15. Центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 30 с для восстановления микроРНК и хранения при -80 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В растворе для стирки может образоваться белый осадок на 2/3. Этот осадок представляет собой избыток ЭДТА, выделяемый из раствора. Избегайте вытягивания этих кристаллов на этапах пипетирования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Безрназные пробирки Safe-lock 1,5 мл	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free 1000 &микро; L советы	Starlab	S1122-1830
Безрназный сейф-замок 2 мл пробирки	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 &микро; L советы	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 &; L советы	Starlab	S1120-8810
mirVana PARIS РНК и набор для очистки нативного белка	Thermo Fisher	AM1556
100% этанол и класс ACS	Реагенты Carlo Erba	414605
2-меркапто-этанол	Sigma-Aldrich	M3148
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 &m; L лабораторные пипетки Вытяжной
шкаф
Настольные микроцентрифуги
вихрь