$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Выделение геномной ДНК из стула
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте коммерческий набор для выделения микробной ДНК из стула в соответствии с протоколом обнаружения патогена в стуле. Достаньте образцы непосредственно из морозильной камеры при температуре -80 °C и храните на сухом льду во время взвешивания.
- Перенесите до 220 мг стула в чистую микропробирку, содержащую 1,4 мл буфера для лизиса кала комнатной температуры (RT) (см. Таблицу материалов).
- Вихревой образец в течение 1 мин для полной гомогенизации твердых веществ (рис. 1В). Нагрейте суспензию до 95 °C в течение 5 минут, чтобы лизировать все бактерии (в том числе грамположительные).
- Вихревые образцы в течение 15 с, а затем центрифугирование при 20 000 x g в течение 1 мин для гранулирования твердых частиц кала. Перенесите надосадочную жидкость в микрофужную пробирку объемом 2 мл. Добавьте по одной таблетке в каждый образец для абсорбции ингибиторов ПЦР, перемешайте до тех пор, пока таблетка не растворится, и инкубируйте образец при ЛТ в течение 1 минуты.
- Центрифугируйте образец при давлении 20 000 x g в течение 3 минут и перенесите надосадочную жидкость в новую микрофуговую пробирку. Центрифуга при плотности 20 000 x g в течение 3 мин. Аликвота 15 мкл протеиназы К (20 мг/мл запаса) в новую микропробирку объемом 1,5 мл. Пипетка 200 мкл образца в пробирку, содержащую протеиназу К.
- Добавьте в пробирку 200 мкл буфера для лизиса хлорида гуанидиния, тщательно перемешайте в течение 15 с (см. Таблицу материалов) и инкубируйте образец при температуре 70 °C в течение 10 мин. Добавьте в пробирки 200 мкл этанола (96-100%) и хорошо перемешайте путем вортексирования.
- Поместите спиновую колонку на основе диоксида кремния в пробирку для сбора объемом 2 мл и нанесите образцы на колонку. Закройте крышку и центрифугуйте на 1 минуту при плотности 20 000 x g.
- Переложите колонку в новую сборную пробирку объемом 2 мл и добавьте в колонку 500 мкл промывочного буфера 1, закройте колонку крышкой и центрифугируйте на 1 мин при концентрации 20 000 х г. Переложите колонку в новую сборную пробирку объемом 2 мл и добавьте в колонку 500 мкл промывочного буфера 2, Закройте крышку и центрифугируйте при температуре 20 000 x g в течение 3 минут.
- Закрыв крышку, перенесите колонку в новую сборную пробирку объемом 2 мл и центрифугируйте еще 1 минуту при давлении 20 000 x g, чтобы удалить остаточный буфер промывки. Перенесите колонку в пробирку с меткой микрофугой объемом 1,5 мл и элюируйте образец, добавив к мембране 200 мкл элюирующего буфера, содержащего ЭДТА (см. Таблицу материалов).
- Закройте крышку и инкубируйте при RT в течение 1 мин. Центрифугируйте образец в течение 1 мин при концентрации 20 000 x g. Выбросьте колонку.
2. Определение концентрации ДНК и подготовка образцов для ПЦР
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте флуориметр и коммерчески доступный флуоресцентный анализ dsDNA для определения концентрации геномной ДНК в каждом образце (см. Таблицу материалов). Флуоресцентный краситель должен специфически связывать двухцепочечную ДНК.
- Приготовьте разведение каждого образца в соотношении 1:200 (1 л каждого образца в мастер-смеси дцДНК объемом 199 мкл) и разведение стандартов в соотношении 1:50. Анализ на флуориметре с использованием настройки dsDNA.
Примечание: Большой объем ДНК в ПЦР может быть тормозным, поэтому используемый объем ДНК не должен превышать 10% от конечного объема ПЦР. Флуориметр позволяет точно измерить ДНК в образце, так как флуоресцировать будет только ДНК, связанная с флуоресцентным красителем, что исключает возможный вклад загрязняющих веществ в окончательную рассчитанную концентрацию ДНК. Такой уровень точного количественного определения имеет важное значение для последующего применения секвенирования.
- Готовят ПЦР-матрицы, разведенные до 5 нг/мкл с соответствующим объемом 10 мМ Трис, pH 8,5 для изготовления рабочих шаблонных запасов каждого образца.
- Хранить образцы при температуре -20 °C.
3. Проектирование грунтовок для 16S Желаемых V-областей
- Разрабатывайте праймеры для селективной амплификации желаемых областей рРНК V 16S.
- Проанализируйте праймеры с помощью Probe Match из проекта Ribosomal Database Project, чтобы определить приблизительную частоту попаданий для различных типов.
Примечание: Для областей V1-V3 в настоящем исследовании использовались опубликованные праймеры Bosshard forward, которые связываются в позиции 8 в области V1, и 533 reverse, которые связываются в позиции 533 в области V3. Праймеры должны включать в себя последовательности адаптеров для индексации.
- При проектировании праймеров включайте адаптерные последовательности на 5'-концах каждого праймера, как рекомендуется для подготовки библиотеки метагеномного секвенирования 16S (табл. 1).
- Синтезируйте эти крупные капсюли с картриджной очисткой. Восстановите высушенные праймеры и разбавьте рабочее вещество ПЦР до 1 мкМ в 10 мМ Трис, pH 8,5.
4. Ампликонная ПЦР для амплификации V-областей с присоединенными последовательностями адаптеров с навесом
- Настройте реакционную смесь ампликона ПЦР, как описано в таблице 2.
- Наложите на планшет клейкую прозрачную пломбу для ПЦР-тарелки и запустите ампликонную ПЦР, используя параметры, указанные в таблице 3.
- (Необязательно) Запустите продукты amplicon PCR на агарозном геле или высокочувствительном анализе ДНК, который позволяет количественно измерить размер ампликона (см. Таблицу материалов).
Примечание: Размер ампликона в этом исследовании составляет 550.н. (Рисунок 2a).
5. Очистка ПЦР с помощью магнитных шариков
- Быстро центрифугируйте ампликоновый ПЦР-планшет при давлении 1 000 x g в течение 1 минуты для сбора конденсата.
заметка: Вместо ПЦР-планшетов можно использовать полоски для ПЦР-пробирок для минимизации загрязнения. Выбросьте крышки от туб и никогда не используйте их повторно.
- Сделайте магнитные шарики вихревыми для равномерного их распределения и добавьте 20 μл магнитных шариков в каждую лунку для ампликонной ПЦР, затем медленно пипетируйте весь объем вверх и вниз 10 раз.
- Инкубируйте при RT в течение 5 мин. Поместите ПЦР-планшет на магнитную подставку на 2 мин, пока магнитные шарики не соберутся и надосадочная жидкость не станет прозрачной. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
- Промойте шарики 200 μл свежего 80% этанола, пока планшет для ПЦР находится на магнитной подставке, и инкубируйте в течение 30 с при RT на магнитной подставке. Осторожно удалите надосадочную жидкость.
- Повторите стирку во второй раз. Теперь с помощью тонкого наконечника для пипетки удалите остатки этанола из лунок и дайте высохнуть на воздухе в течение 10 минут.
- Снимите ПЦР-планшет с магнитной стойки и добавьте в каждую лунку 52,5 мкл 10 мМ Трис pH 8,5. Пипеткой вверх и вниз 10 раз взвесьте шарики и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 минут.
- Перенесите ПЦР-планшет на магнитный стенд для сбора магнитных шариков и перенесите 50 мкл надосадочной жидкости на чистый ПЦР-планшет. Поместите на планшет клейкую прозрачную пломбу для ПЦР-планшета и храните при температуре -20 °C до одной недели.
| Amplicon PCR Праймеры |
| вперёд | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3' |
| обратный | 5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3' |
| Последовательности, специфичные для локуса, выделены жирным шрифтом, а нежирным шрифтом выделена последовательность адаптеров с выступающим шрифтом. |
Таблица 1: Праймеры Amplicon PCR.
| Настройка реакции ПЦР с ампликоном | |
| том |
| Микробная ДНК (5 нг/л) | 2,5 мкл |
| Прямой праймер (1 мкМ; с шага 3.1) | 5,0 мкл |
| Обратный праймер (1 мкМ; с шага 3.1) | 5,0 мкл |
| 2X HotStart Готовый микс | 12,5 мкл |
| итог | 25,0 мкл |
Таблица 2: Праймеры Amplicon PCR.
| Настройка ПЦР с ампликоном |
| 95 °C в течение 3 минут | |
| 25 циклов: | |
| 95 °C в течение 30 секунд |
| 55 °C в течение 30 секунд |
| 72 °C в течение 60 секунд |
| 72 °C в течение 3 минут | |
| Держать при температуре 4 °C | |
Таблица 3: Настройка программы Amplicon PCR.
