1. Генерация органоидов CRC, культивируемых на искусственном внеклеточном матриксе
Экспериментальные процедуры для культивирования органоидов CRC PDX толстой кишки описаны на рисунке 1B (шаг 4).
- Создать питательную среду, подходящую для органоидов CRC, полученных из PDX (см. Таблицу материалов, «культуральная среда для органоидов CRC»), используя среды, ранее описанные для органоидов толстой кишки человека.
- Нанесите 150 μL искусственного внеклеточного матрикса (см. Таблицу материалов) на лунку на 12-луночный планшет на льду, а затем инкубируйте его в течение 30-60 минут в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 для затвердевания гелей.
- Суспензировать клеточную гранулу клеток CRC, полученную из мышиной модели PDX, с питательной средой для органоидов CRC (с шага 1.1) с 5% FCS для доведения до 3 x 105 клеток/мл. Затем высадите 1 мл среды на искусственную пластину, покрытую внеклеточным матриксом, приготовленную на стадии 1.2, и инкубируйте в течение ночи при 37 °C при 5%CO2. Используйте гемоцитометр для подсчета количества опухолевых клеток, включая одиночные клетки и многоклеточные кластеры (группу адгезивных клеток) в клеточной суспензии.
Примечание: 5% FCS используется для гашения остаточной ферментативной активности коллагеназы в этом исследовании.
- На следующий день тщательно соберите питательную среду, включая плавающие клетки, отделенные от пластины, покрытой искусственным внеклеточным матриксом, в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте ее при давлении 1400 x g в течение 5 минут. Затем удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 70 мкл искусственного внеклеточного матрикса на льду.
- Чтобы повысить жизнеспособность клеток CRC, наложите содержащий опухолевую клетку искусственный внеклеточный матрикс на опухолевые органоидные клетки, прикрепленные к пластине, покрытой искусственным внеклеточным матриксом, и инкубируйте в течение 30 мин в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2 затвердевают покрытие искусственного внеклеточного матрикса. Затем инкубируйте его с 1 мл среды для культуры органоидных клеток CRC с 1% FCS при 37 °C при 5%CO2.
- Меняйте питательную среду каждый второй день. Поскольку органоиды CRC заполняют среду, может возникнуть необходимость в ежедневной смене среды.
2. Генерация и обогащение лентивирусных частиц GFP
Экспериментальные процедуры генерации и обогащения лентивирусных частиц GFP описаны на рисунке 1C (шаг 5).
- Культивируют HEK293T клетки средой Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, содержащей 10% FCS, и готовят шесть посуды размером 10 см (2 x 10по 6 клеток на чашку) для последующей процедуры трансфекции.
- Для трансфекции на чашку приготовьте 500 мкл смеси, включающей 20 мкл реагента для трансфекции в DMEM с вектором PRRL-GFP (5 мкг) и двумя лентивирусными упаковочными плазмидами, такими как pCMV-VSV-G (1 мкг) и pCMV-dR8.2 dvpr (5 мкг), в стерильной микропробирке объемом 1,5 мл. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем наложите ее на каждую из 10-сантиметровых посуды и выдержите их в течение 18 часов.
- Удалите среду, добавьте 5 мл свежей 10% среды FCS-RPMI 1640 в каждое блюдо и оставьте на 24 часа.
- Соберите кондиционированную среду из каждой чашки в центрифужную пробирку объемом 50 мл и храните в общей сложности 30 мл среды при температуре 4 °C в течение ночи. Добавьте по 5 мл свежего RPMI 1640 в каждую тарелку и оставьте на 24 часа.
- Соберите кондиционированную среду из каждой чашки в центрифужную пробирку объемом 50 мл и держите в общей сложности 30 мл среды на льду. Затем выбросьте клетки.
- Отфильтруйте 60 мл среды (с этапов 2,4-2,5) через фильтр 0,45 мкм, чтобы удалить клетки, и разделите это количество на двенадцать полипропиленовых центрифужных пробирок по 5 мл для ультрацентрифугирования.
- Чтобы концентрировать вирусы, центрифугируйте их с помощью качающегося ротора при давлении 85 327 x g в течение 1,5 ч при 4 °C.
- Немедленно удалите среду. Чтобы растворить концентрированную вирусную гранулу, поместите 250 μL питательной ветчинной смеси F-12 (F12)/DMEM среды без FCS в каждую из двенадцати пробирок и поддерживайте ее при температуре 4 °C в течение ночи. Обратите внимание, что вирусная гранула часто незаметна.
- Осторожно пипетируйте среду, чтобы собрать 3 мл концентрированного 5-кратного запаса лентивируса GFP, в общей сложности, предположительно включая частицы лентивируса GFP с10-8 трансдуцирующими единицами на мл (TU/мл). Затем храните двенадцать микропробирок объемом 1,5 мл (включая 250 мл на пробирку) в стерильных условиях при температуре -80 °C в течение года. Приготовьте много небольших аликвот исходного раствора, чтобы избежать многократных циклов замораживания-оттаивания.
3. Мечение клеток органоида CRC лентивирусными частицами GFP, культивируемыми на искусственном внеклеточном матриксе
Экспериментальные процедуры мечения органоидных клеток CRC лентивирусом GFP описаны на рисунке 1C (шаг 6).
- Дайте органоидам CRC, приготовленным на шаге 1.6, расти без помех в течение 7-10 дней, соберите их механическим способом с помощью скребка для стерильных клеток и перенесите в микропробирку объемом 1,5 мл><.
заметка: Рост органоидов CRC в культуре зависит от характера исходных опухолей у пациентов. Избегайте чрезмерного роста органоидов CRC, поддерживая их на уровне 60-70% слияния перед переносом в соотношении 1:2 на новую 12-луночную пластину, покрытую искусственным внеклеточным матриксом.
- Центрифугируйте микропробирку в течение 3 мин при давлении 1 400 x g, удалите питательную среду и растворите клеточную гранулу в 500 мкл PBS путем осторожного постукивания.
- Центрифугируйте микропробирку в течение 3 мин при давлении 1 400 x g и устраните PBS.
- Чтобы диссоциировать адгезивные органоиды CRC, добавьте 500 мкл раствора клеточной дисперсии протеолитических и коллагенолитических ферментов в клеточную гранулу в пробирке и перемешайте его легким постукиванием. Затем оставьте трубки отстояться на 10 минут при комнатной температуре.
- Очень аккуратно пипетируйте клеточную суспензию еще 500 мкл 1% FCS-DMEM несколько раз в микропробирку объемом 1,5 мл для грубой диссоциации клеток. Получение одиночных клеток из органоидов CRC путем жесткого пипетирования заметно снижает жизнеспособность клеток. Таким образом, важно оставлять массу клеток визуально обнаруживаемой в клеточной суспензии путем аккуратного пипетирования в микропробирке объемом 1,5 мл.
- Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 3 мин при давлении 1 400 x g и удалите надосадочную жидкость.
- Растворите клеточную гранулу смесью 100 мкл 5-кратного запаса лентивируса GFP (>108 ТЕ/мл) и 400 мкл питательной среды органоида CRC в микропробирке объемом 1,5 мл путем осторожного постукивания до концентрации5 x 10 5 диссоциированных опухолевых клеток на 500 мкл. Используйте гемоцитометр для подсчета количества опухолевых клеток, включая отдельные клетки и группы клеток в клеточной суспензии, как описано выше (шаг 1.3).
- Приготовьте 12-луночный планшет с искусственным покрытием из внеклеточного матрикса, как описано в шаге 1.2. Затем поместите 500 мкл клеточной суспензии, приготовленной на этапе 3.7, на планшет и оставьте на 18 ч при 37 °C при 5%CO2.
- Соберите среду с плавающими клетками, отделенными от пластины, покрытой искусственным внеклеточным матриксом, в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируйте его при давлении 1400 x g, а затем удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 70 мкл искусственного внеклеточного матрикса на льду.
- Чтобы повысить жизнеспособность клеток CRC, наложите содержащий опухолевую клетку искусственный внеклеточный матрикс на опухолевые органоиды, прикрепленные к 12-луночной пластине, покрытой искусственным внеклеточным матриксом, как описано в шаге 1.5. Затем инкубируют планшет в течение 30 минут в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 для затвердевания покрытия искусственного внеклеточного матрикса, а затем культивируют его 1 мл органоидной питательной среды CRC с 1% FCS при 37 °C при 5%CO2.
- Наблюдайте за клетками через три дня после заражения под флуоресцентным микроскопом, чтобы подтвердить почти 100% положительный результат GFP из-за использования высокого титра лентивирусных частиц (см. рисунок 2A).
- Культивируйте органоиды CRC в течение 7-10 дней для расширения роста клеток перед инъекцией мышам-реципиентам.
