Мечение органоидных клеток CRC: метод получения органоидных клеток колоректального рака, трансдуцированных лентивирусом GFP

Аннотация

Источник: Okazawa Y. et al., Высокочувствительное обнаружение микрометастазов, генерируемых органоидами, трансдуцированными лентивирусом GFP, культивируемыми из опухоли толстой кишки, полученной от пациента. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает технику генерации органоидов CRC, трансдуцированных лентивирусными частицами GFP для обеспечения флуоресцентной визуализации. Эти меченые GFP органоиды при размещении на животных моделях помогают изучать опухолевую инвазию и метастазирование.

Протокол

1. Генерация органоидов CRC, культивируемых на искусственном внеклеточном матриксе

Экспериментальные процедуры для культивирования органоидов CRC PDX толстой кишки описаны на рисунке 1B (шаг 4).

1. Создать питательную среду, подходящую для органоидов CRC, полученных из PDX (см. Таблицу материалов, «культуральная среда для органоидов CRC»), используя среды, ранее описанные для органоидов толстой кишки человека.
2. Нанесите 150 μL искусственного внеклеточного матрикса (см. Таблицу материалов) на лунку на 12-луночный планшет на льду, а затем инкубируйте его в т....

Результаты

Рисунок 1: Схематическое изображение генерации метастазов органоидами CRC, полученными из PDX, меченными лентивирусом GFP у мышей NOG.(А) Имплантация небольших кусочков ткани КРР подкожно мышам с NOG (шаг 1). Ткань CRC, хирургически отделенная у пациента, была разрезана на части и имплантирована подкожно мышам NOG. s.c.: подкожная имплантация. (B) Генерац.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
12-луночный планшет	BMBio	#92412
микротрубка	Эппендорф	#0030120086	Автоклав перед использованием
Гемоцитометр	Эрма	#03-202-1
Матрица базальной мембраны Matrigel	Корнинг	#354234	Хранить аликвоты при температуре -20°C. Положите на лед до использования
Коллагеназа 1 типа	сигма	#C1030	150 мг/мл коллагеназы типа1 в 1×PBS. Хранить аликвоты при температуре -20°C до 1 года
DMEM/F-12 с GlutaMAX™	Gibco	#10565018
пенициллин	Gibco	#15140122	Хранить при температуре 4°C. Использовать в течение 1 месяца
hEGF	ПЕПРОТЕХ	#AF-100-15	Хранить при температуре -20°C. Добавить в среду в тот же день после использования
Y27632, ингибитор ROCK	Вако	#253-00591	Хранить при температуре -20°C. Добавить в среду в тот же день после использования
стрептомицин	Gibco	#15140122	Хранить при температуре 4°C. Использовать в течение 1 месяца
Питательная среда для органоидов CRC с 1% или 5% FCS			DMEM/F-12 с добавкой GlutaMAX™ (Gibco #10565018) с добавлением 1% или 5% FCS, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 нг/мл hEGF и 10 мкМ Y27632, ингибитора ROCK. Хранить при температуре 4°C. Использовать в течение 1 месяца.
Вектор PRRL-GFP	Подарок от доктора Роберта А. Вайнберга
трансфекционный регент FuGENE 6	Рош	11814 443001
pCMV-VSV-G	Подарок от доктора Роберта А. Вайнберга
pCMV-dR8.2 dvpr	Подарок от доктора Роберта А. Вайнберга
стереофлуоресцентный микроскоп Zeiss Axioplan 2	Цейсс