$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Вскрытие CRC PDX у мышей
Экспериментальные процедуры препарирования PDX CRC описаны на рисунке 1B (шаг 2).
- Дайте опухоли вырасти подкожно до ~1 см3 в размере, что обычно занимает примерно 1-3 месяца.
- Обезболите мышь ингаляцией изофлураном с помощью устройства для ингаляционной анестезии мелких животных и продезинфицируйте кожу 70% этанолом.
- Положите мышь в положение лежа на лабораторный стол. Надрежьте кожу, обнажите опухоль и аккуратно отделите кожу от опухоли с помощью стерильных ножниц. После удаления опухоли поместите ее на чашку Петри высотой 10 см, удалите все грубо некротизированные участки опухоли, а затем дважды промойте 5 мл PBS.
заметка: Некротические участки часто белее, мягче и рыхлее, чем окружающие участки.
- Поместите опухоль на лед и разделите ее поровну как минимум на 4 части для различных применений, включая 1) культуру органоидов CRC, 2) трансплантацию вторичным мышам, 3) гистологическое исследование и 4) замораживание и хранение фрагментов опухоли.
- Для получения органоидов CRC поместите ткань солидной опухоли на чашку Петри диаметром 6 см, содержащую 1 мл стерильного PBS. Держите салфетку на льду до обработки.
- Чтобы создать модель PDX для CRC человека, пропустите свежие PDX CRC во вторичную мышь. Разрежьте опухолевую ткань на небольшие кусочки (размером 5 х 5 х 5 мм3 дюйма) с помощью стерильных бритвенных лезвий и аккуратно опустите эти фрагменты ткани в 50 мкл искусственного внеклеточного матрикса. Затем имплантируйте эти фрагменты в нижние части правого и левого подкожных карманов мыши NOG.
- Поместите мышь под наркозом в положение лежа на лабораторном столе. Сделайте небольшой разрез на нижних частях правого и левого боков мыши-реципиента для создания подкожных карманов для имплантации тканей с помощью стерильных ножниц. Следите за тем, чтобы не проколоть перитонеальную оболочку. При этой процедуре должно быть небольшое кровотечение.
- Аккуратно опустите подготовленные выше фрагменты опухоли в 50 μл искусственного внеклеточного матрикса, а затем имплантируйте их в нижние части правого и левого подкожных карманов.
- Сшить разрез с помощью раневых зажимов у мышей, подвергающихся хирургическим процедурам. Убедитесь, что имплантированные опухолевые ткани расположены на некотором расстоянии от разреза под кожей.
заметка: В соответствии с минимизацией хирургических процедур, в этом исследовании не применялось лечение послеоперационной боли и инфекции.
- Положите мышь на теплый коврик и сохраняйте лежачее положение на грудине до тех пор, пока не восстановится достаточное сознание. Как только мыши полностью выздоровеют и смогут сидеть на всех четырех лапах, их можно вернуть в их домашние клетки. Чтобы предотвратить хищничество, не допускайте скрещивания с неоперированными животными в одной клетке.
- Для гистологического анализа зафиксировать образцы в 5 мл 10% нейтрального буферизованного формалина в конической пробирке объемом 15 мл при комнатной температуре в течение 2 суток.
- Для криоконсервации разрежьте опухолевую ткань на небольшие кусочки (размером 5 x 5 x 5 мм3 дюйма) и аккуратно опустите образцы в 500 μL раствора для замораживания клеток в криовиальных пробирках объемом 1-1,5 мл. Затем перенесите пробирку в морозильную камеру при температуре -80 °C.
2. Экстракция PDX в клеточную суспензию для культуры органоидов CRC
Экспериментальные процедуры диссоциации PDX CRC описаны на рисунке 1B (шаг 3).
- Поместите вышеуказанные (шаг 1.4.1) подготовленные фрагменты опухоли на чашку Петри высотой 10 см.
- Измельчите фрагменты с помощью стерильных бритвенных лезвий и переложите их в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 8 мл 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS)-модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) с 80 мкл запаса ферментов коллагеназы (см. Таблицу материалов).
- Плотно закройте тюбик и оберните крышку парапленкой, чтобы предотвратить протекание. Чтобы диссоциировать измельченные фрагменты опухоли в клеточную суспензию, осторожно перемешивайте ее в течение 2 ч при 37 °C. Учтите, что в пробирке все еще останется много фрагментов непереваренной ткани.
- Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C и удалите надосадочную жидкость. Растворите клеточную гранулу с помощью 10 мл 10% FCS-DMEM для получения клеточной суспензии.
- Чтобы удалить непереваренные остатки тканей, дважды отфильтруйте клеточную суспензию с помощью клеточного фильтра 40 мкм, установленного на конической трубке объемом 50 мл. Затем центрифугируйте проточный поток при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и держите гранулу на льду.
3. Генерация органоидов CRC, культивируемых на искусственном внеклеточном матриксе
Экспериментальные процедуры для культивирования органоидов CRC PDX толстой кишки описаны на рисунке 1B (шаг 4).
- Создать питательную среду, подходящую для органоидов CRC, полученных из PDX (см. Таблицу материалов, «культуральная среда для органоидов CRC»), используя среды, ранее описанные для органоидов толстой кишки человека.
- Нанесите 150 μL искусственного внеклеточного матрикса (см. Таблицу материалов) на лунку на 12-луночный планшет на льду, а затем инкубируйте его в течение 30-60 минут в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 для затвердевания гелей.
- Суспензию клеточной гранулы с этапа 2.5 с питательной средой для органоидов CRC (с этапа 3.1) с 5% FCS до достижения корректировки до 3 x 105 клеток/мл. Затем засейте 1 мл среды на планшет с искусственным внеклеточным матриксом, приготовленный на шаге 3.2. и инкубировать в течение ночи при 37 °C при 5%CO2. Используйте гемоцитометр для подсчета количества опухолевых клеток, включая одиночные клетки и многоклеточные кластеры (группу адгезивных клеток) в клеточной суспензии.
Примечание: 5% FCS используется для гашения остаточной ферментативной активности коллагеназы в этом исследовании.
- На следующий день тщательно соберите питательную среду, включая плавающие клетки, отделенные от пластины, покрытой искусственным внеклеточным матриксом, в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте ее при давлении 1400 x g в течение 5 минут. Затем удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 70 мкл искусственного внеклеточного матрикса на льду.
- Чтобы повысить жизнеспособность клеток CRC, наложите содержащий опухолевую клетку искусственный внеклеточный матрикс на опухолевые органоидные клетки, прикрепленные к пластине, покрытой искусственным внеклеточным матриксом, и инкубируйте в течение 30 мин в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2 затвердевают покрытие искусственного внеклеточного матрикса. Затем инкубируйте его с 1 мл среды для культуры органоидных клеток CRC с 1% FCS при 37 °C при 5%CO2.
- Меняйте питательную среду каждый второй день. Поскольку органоиды CRC заполняют среду, может возникнуть необходимость в ежедневной смене среды.
4. Генерация и обогащение лентивирусных частиц GFP
Экспериментальные процедуры генерации и обогащения лентивирусных частиц GFP описаны на рисунке 1C (шаг 5).
- Культивируют HEK293T клетки средой Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, содержащей 10% FCS, и готовят шесть посуды размером 10 см (2 x 10по 6 клеток на чашку) для последующей процедуры трансфекции.
- Для трансфекции на чашку приготовьте 500 мкл смеси, включающей 20 мкл реагента для трансфекции в DMEM с вектором PRRL-GFP (5 мкг)12 и двумя лентивирусными упаковочными плазмидами, такими как pCMV-VSV-G (1 мкг) и pCMV-dR8.2 dvpr (5 мкг), в стерильной микропробирке объемом 1,5 мл. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем наложите ее на каждую из 10-сантиметровых посуды и выдержите их в течение 18 часов.
- Удалите среду, добавьте 5 мл свежей 10% среды FCS-RPMI 1640 в каждое блюдо и оставьте на 24 часа.
- Соберите кондиционированную среду из каждой чашки в центрифужную пробирку объемом 50 мл и храните в общей сложности 30 мл среды при температуре 4 °C в течение ночи. Добавьте по 5 мл свежего RPMI 1640 на каждую посуду и оставьте на 24 часа.
- Соберите кондиционированную среду из каждой чашки в центрифужную пробирку объемом 50 мл и держите в общей сложности 30 мл среды на льду. Затем выбросьте клетки.
- Отфильтруйте 60 мл среды (с этапов 4,4-4,5) через фильтр 0,45 мкм, чтобы удалить клетки, и разделите это количество на двенадцать полипропиленовых центрифужных пробирок по 5 мл для ультрацентрифугирования.
- Чтобы сконцентрировать вирусы, центрифугируйте их с помощью качающегося ротора ковша (см. Таблицу материалов) при 85 327 x g в течение 1,5 ч при 4 °C.
- Немедленно удалите среду. Чтобы растворить концентрированную вирусную гранулу, поместите 250 μL питательной ветчинной смеси F-12 (F12)/DMEM среды без FCS в каждую из двенадцати пробирок и поддерживайте ее при температуре 4 °C в течение ночи. Обратите внимание, что вирусная гранула часто незаметна.
- Осторожно пипетируйте среду, чтобы собрать 3 мл концентрированного 5-кратного запаса лентивируса GFP, в общей сложности, предположительно включая частицы лентивируса GFP с10-8 трансдуцирующими единицами на мл (TU/мл). Затем храните двенадцать микропробирок объемом 1,5 мл (включая 250 мл на пробирку) в стерильных условиях при температуре -80 °C в течение года. Приготовьте много небольших аликвот исходного раствора, чтобы избежать многократных циклов замораживания-оттаивания.
5. Мечение клеток органоида CRC лентивирусными частицами GFP, культивируемыми на искусственном внеклеточном матриксе
Экспериментальные процедуры мечения органоидных клеток CRC лентивирусом GFP описаны на рисунке 1C (шаг 6).
- Дайте органоидам CRC, приготовленным на шаге 3.6, расти без помех в течение 7-10 дней, соберите их механическим способом с помощью стерильного скребка для клеток, а затем перенесите в микропробирку объемом 1,5 мл><.
заметка: Рост органоидов CRC в культуре зависит от характера исходных опухолей у пациентов. Избегайте чрезмерного роста органоидов CRC, поддерживая их на уровне 60-70% слияния перед переносом в соотношении 1:2 на новую 12-луночную пластину, покрытую искусственным внеклеточным матриксом.
- Центрифугируйте микропробирку в течение 3 мин при давлении 1 400 x g, удалите питательную среду и растворите клеточную гранулу в 500 мкл PBS путем осторожного постукивания.
- Центрифугируйте микропробирку в течение 3 мин при давлении 1 400 x g и устраните PBS.
- Чтобы диссоциировать адгезивные органоиды CRC, добавьте 500 мкл раствора клеточной дисперсии протеолитических и коллагенолитических ферментов в клеточную гранулу в пробирке и перемешайте его легким постукиванием. Затем оставьте трубки отстояться на 10 минут при комнатной температуре.
- Очень аккуратно пипетируйте клеточную суспензию еще 500 мкл 1% FCS-DMEM несколько раз в микропробирку объемом 1,5 мл для грубой диссоциации клеток. Получение одиночных клеток из органоидов CRC путем жесткого пипетирования заметно снижает жизнеспособность клеток. Таким образом, важно оставлять массу клеток визуально обнаруживаемой в клеточной суспензии путем аккуратного пипетирования в микропробирке объемом 1,5 мл.
- Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 3 мин при давлении 1 400 x g и удалите надосадочную жидкость.
- Растворите клеточную гранулу смесью 100 мкл 5-кратного запаса лентивируса GFP (>108 ТЕ/мл) и 400 мкл питательной среды для органоидов CRC в микропробирке объемом 1,5 мл путем осторожного постукивания до концентрации 5 x 105 диссоциированных опухолевых клеток на 500 мкл. Используйте гемоцитометр для подсчета количества опухолевых клеток, включая отдельные клетки и группы клеток в клеточной суспензии, как описано выше (шаг 3.3).
- Приготовьте 12-луночный планшет с искусственным покрытием из внеклеточного матрикса, как описано в шаге 3.2. Затем поместите 500 мкл клеточной суспензии, приготовленной на шаге 5.7, на планшет и оставьте на 18 ч при 37 °C при 5%CO2.
- Соберите среду с плавающими клетками, отделенными от пластины, покрытой искусственным внеклеточным матриксом, в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируйте его при давлении 1400 x g, а затем удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 70 мкл искусственного внеклеточного матрикса на льду.
- Чтобы повысить жизнеспособность клеток CRC, наложите содержащий опухолевую клетку искусственный внеклеточный матрикс на опухолевые органоиды, прикрепленные к 12-луночной пластине, покрытой искусственным внеклеточным матриксом, как описано в шаге 3.5. Затем инкубируют планшет в течение 30 минут в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 для затвердевания покрытия искусственного внеклеточного матрикса, а затем культивируют его 1 мл органоидной питательной среды CRC с 1% FCS при 37 °C при 5%CO2.
- Наблюдайте за клетками через 3 дня после инфекции под флуоресцентным микроскопом, чтобы подтвердить почти 100% положительный результат GFP благодаря использованию высокого титра лентивирусных частиц (см. рисунок 2A).
- Культивируйте органоиды CRC в течение 7-10 дней для расширения роста клеток перед инъекцией мышам-реципиентам.
6. Генерация метастазов GFP-мечеными CRC-органоидами у мышей-реципиентов
Экспериментальные процедуры генерации метастазов с использованием меченых GFP органоидов CRC описаны на рисунке 1C (шаг 7).
- Чтобы диссоциировать меченые GFP органоиды CRC в клеточную суспензию, собирают их механически с помощью стерильного скребка для клеток и переносят в микропробирку объемом 1,5 мл, как описано выше (шаг 5.1).
- Центрифугируйте микропробирку в течение 3 минут при давлении 1 400 x g, удалите питательную среду и растворите клеточную гранулу в 500 мкл PBS путем осторожного постукивания.
- Центрифугируйте микропробирку в течение 3 мин при давлении 1 400 x g и устраните PBS.
- Налейте 500 μл раствора для отделения клеток на гранулу клетки в пробирке и перемешайте ее легкими постукиваниями. Затем оставьте смесь на 10 минут при комнатной температуре для ферментативной диссоциации адгезивных органоидов CRC, как описано выше (шаг 5.4).
- Очень аккуратно пипетируйте клеточную суспензию еще 500 мкл 1% FCS-DMEM несколько раз в микропробирке объемом 1,5 мл для грубой диссоциации клеток, как описано выше (шаг 5.5). Получение одиночных клеток из органоидов CRC путем жесткого пипетирования заметно снижает жизнеспособность клеток. Таким образом, оставьте массу клеток визуально обнаруживаемой в клеточной суспензии путем аккуратного пипетирования в микропробирке объемом 1,5 мл.
- Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 3 мин при давлении 1 400 x g и удалите надосадочную жидкость.
- Чтобы установить мышиную модель PDX с методом спонтанного метастазирования:
- Приготовьте клеточную суспензию, включающую 5 x10-5 клеток в 50 мкл PBS с 50% искусственным внеклеточным матриксом на мышь. Перед использованием поддержите суспензию на льду. Используйте гемоцитометр для подсчета раковых клеток, как указано в пункте 3.3.
- Обезболите мышь ингаляцией изофлурана с помощью аппарата для ингаляционной анестезии мелких животных и продезинфицируйте кожу 70% этанолом. Обеспечьте нормальную частоту и глубину дыхания и отсутствие рефлекса защемления пальцев ног для правильной анестезии. Ветеринарная мазь для глаз – это вариант профилактики сухости глаз во время пребывания под наркозом.
- Поместите мышь NOG в лежачем положении на лабораторный стол. Обхватите слизистую прямую кишку стерильным пинцетом и аккуратно вытяните ее из анального отверстия. Затем немедленно вводят клеточную суспензию, приготовленную на шаге 6.7.1, в подслизистую оболочку прямой кишки мыши с помощью шприца (размер иглы: 22 G). Как правило, для оценки результатов используется 4-6 мышей в группе.
