Создание экспериментальной модели метастазов на мыши: имплантация GFP, экспрессирующих органоидные клетки CRC, в модель PDX для обнаружения микрометастазов

Аннотация

Источник: Okazawa, Y. et al. Высокочувствительное обнаружение микрометастазов, генерируемых органоидами, трансдуцированными лентивирусом GFP, культивируемыми из опухоли толстой кишки, полученной от пациента. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео описывается протокол генерации метастазов из полученных PDX органоидов CRC, меченных лентивирусом GFP, в селезенку иммунодефицитной мыши. Раковые микрометастазы, колонизирующие другие органы, могут быть обнаружены с помощью флуоресцентного микроскопа для оценки экспрессии GFP.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Генерация метастазов с помощью GFP-меченых органоидов CRC у мышей-реципиентов

1. Для создания экспериментальной модели метастазирования PDX CRC:
   1. Приготовьте суспензию органоидных клеток CRC, включающую 4 x 10 4 клетки в 50 мкл PBS на мышь. Перед использованием поддержите суспензию на льду. Используйте гемоцитометр для подсчета раковых клеток. (Подсчитайте количество опухолевых клеток, включая одиночные клетки и многоклеточные кластеры в клеточной суспензии).
   2. Обезболите мышь ингаляцией изофлурана с помощью аппарата для ингаляционной анестезии мелких животных и продезинфицируйте кожу 70% этанолом. Обеспечьте нормальную частоту и глубину дыхания и отсутствие рефлекса защемления пальцев ног для правильной анестезии. Ветеринарная мазь на глаза – это вариант, чтобы предотвратить сухость глаз во время пребывания под наркозом.
   3. Поместите мышь под наркозом NOG в положение лежа на лабораторном столе. Сделайте небольшой надрез на нижней части левого бока, а затем разрежьте брюшину, чтобы аккуратно обнажить селезенку, с помощью стерильных ножниц и пинцета. Обхватите жировую ткань, прикрепленную к селезенке, стерильным пинцетом, затем медленно введите 50 мкл клеточной суспензии (приготовленной, как указано выше, шаг 1.1) в селезенку. Убедитесь, что клеточная суспензия вводится надлежащим образом, без утечки наружу, из селезенки. Как правило, для оценки результатов используется 4 мыши в группе.
2. После операции поместите всех мышей на теплую подушку и поддерживайте в лежачем положении на грудине до тех пор, пока не восстановится достаточное сознание. Как только мыши полностью выздоровеют и смогут сидеть на всех четырех лапах, верните их в домашние клетки. Чтобы предотвратить хищничество, не допускайте скрещивания с неоперированными животными в одной клетке.
3. Проверьте наличие подтекания швов и подтвердите, что мыши живы в группе, подвергшейся хирургическому лечению, на следующий день. Проверяйте мышей на наличие признаков болезни и измеряйте размеры опухолей с помощью штангенциркуля у всех мышей один раз в неделю.
4. Наблюдайте за мышами для выявления спонтанных метастазов (в течение периода до 2,5 месяцев) и экспериментальных метастазов (1 месяц) после инъекции.
5. Умерщвляйте мышей с помощью анестезии и вывиха шейки матки в указанные дни. Препарируйте первичные опухоли и различные ткани, включая печень и легкие. Поместите вскрытые опухоли и органы в 5 мл ледяного PBS на чашку Петри диаметром 10 см и храните их на льду.
6. Чтобы обнаружить GFP-положительные органоидные клетки CRC, наблюдайте за рассеченными тканями под стереофлуоресцентным микроскопом. Получение изображений с помощью ПЗС-камеры и подготовка изображений с помощью стандартного программного обеспечения для обработки изображений

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Мыши NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG)	Центральный институт экспериментальных животных, Канагава, Япония	Выращивание 6-недельных самцов мышей в условиях, свободных от микробов и специфических патогенов
Намоточные зажимы 2×10мм	Производство Нацумэ, Япония	#C-21-С	Автоклав перед использованием
Размер иглы шприца Hamilton: 22 калибр	Tokyo Science, Япония	Дезинфицировать 70% спиртом и стерильным PBS.
Коническая трубка 50 мл	Сумитомо Бакелитовый	МС-57500
микротрубка	Эппендорф	#0030120086	Автоклав перед использованием
Гемоцитометр	Эрма	#03-202-1
Питательная среда для органоидов CRC с 1% или 5% FCS			DMEM/F-12 с добавкой GlutaMAX™ (Gibco #10565018) с добавлением 1% или 5% FCS, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 нг/мл hEGF и 10 мкМ Y27632, ингибитора ROCK. Хранить при температуре 4°C. Использовать в течение 1 месяца.
стереофлуоресцентный микроскоп Zeiss Axioplan 2	Цейсс