Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Локальная индукция опухоли через хирургическую адено-креновую инфекцию
- Подготовка животных к операции
заметка: Практически любая условная («флоксированная») мутация может быть индуцирована с помощью описанного здесь метода. Рекомендуется использовать мутации в генах, имеющих отношение к колоректальному раку, таких как Apc, Kras или Tp53. Эффективность рекомбинации Cre зависит от размера иссекаемой конструкции. Большие флоксированные последовательности иссекаются менее эффективно. Рекомбинация всех аллелей должна быть подтверждена в опухолях методом ПЦР.
- Для развития колоректальных опухолей используйте скрещивание следующих условных аллелей для базовой модели КРР (номер базы данных MGI в скобках):
БТРtm2Rak (MGI: 3688435)
Krastm4Tyj (MGI: 2429948)
Tp53tm2Tyj (MGI: 3039263)
- Если требуется флуоресцентный репортерный аллель (например, для обнаружения микрометастазов), используйте следующий аллель:
Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze (MGI: 3809522)
заметка: Все вышеперечисленные штаммы доступны в репозитории NCI Mouse Repository или в лаборатории Джексона. Голодание не требуется, так как все оставшиеся каловые массы могут быть вымыты до аденовирусной инфекции. Предоперационное голодание приводит к более высокой периоперационной смертности и представляет собой огромный стресс для мелких грызунов.
- Используйте севофлуран в дозе 3 - 3,5 об.% для общей анестезии. Потеря рефлекса защемления пальца ноги свидетельствует о достаточной анестезии.
- Перед первым разрезом подкожно вводят 0,05 мг/кг бупренорфина.
- Накройте глаза мыши, находящейся под наркозом, офтальмологической мазью, чтобы избежать высыхания роговицы.
- Поместите мышь в лежачем положении на небольшой столик. Используйте нетравматичные клейкие ленты для фиксации мыши.
- Побрейте живот электробритвой (в качестве альтернативы можно использовать крем для депиляции) и продезинфицируйте спиртовыми тампонами или йодом. Используйте время контакта, рекомендованное производителем.
- Накройте операционное поле стерильными простынями.
заметка: Использование периоперационных антибиотиков является необязательным и регулируется институциональными рекомендациями.
- Используйте стерильные одноразовые или стерилизованные инструменты для всех хирургических процедур.
- Срединная лапаротомия и обнажение толстой кишки
- С помощью ножниц (в качестве альтернативы можно использовать скальпели) сделайте разрез по средней линии (~15 мм) на коже нижней части живота.
- Подхватите щипцами мускулатуру брюшной стенки и аккуратно разрежьте ее ножницами, открывая брюшную полость.
- Определите дистальный отдел ободочной кишки, только прикасайтесь к нему атравматичными щипцами. Зажмите толстую кишку тонким зажимом (например, сосудистым зажимом Micro Serrefine) примерно на 15 мм проксимальнее анального отверстия.
заметка: Всегда уделяйте особое внимание уязвимости толстой кишки. Перфорация неизбежно приводит к перитониту и сепсису и требует эвтаназии животного.
- Сегментарная инфекция толстой кишки вирусом Adeno-cre
- Вставьте гибкую тефлоновую трубку трансанально и осторожно продвигайте ее до тех пор, пока она не достигнет окклюзии просвета, достигнутой зажимом, ранее размещенным на расстоянии 15 мм от анального края. Не прилагайте чрезмерных усилий, так как это может привести к перфорации.
- Канюля проложите трубку с помощью канюли 30G, подключите стандартный шприц объемом 1 мл и промойте толстую кишку обычным физиологическим раствором, чтобы эвакуировать оставшиеся каловые массы. Для этого может потребоваться несколько мл физиологического раствора.
- Как только дистальный отдел толстой кишки опустеет, извлеките трубку и замените ее свежей тефлоновой трубкой и снова расположите ее прямо дистальнее зажима, как описано выше.
- Окклюзируйте толстую кишку вторым зажимом на расстоянии ~ 3 мм дистальнее проксимального зажима (т.е. над введенной трубкой, ~ 12 мм от анального края), в результате чего изолированный сегмент толщиной 3 мм будет инфицирован.
заметка: Для дистальной окклюзии сегмента наиболее подходящими оказались клипсы для коронарных артерий Фогарти, так как они прорезинены, что приводит к плотной окклюзии толстой кишки, несмотря на наличие внутрипросветной трубки между ветвями зажима.
- С помощью второго шприца (стандартный 1 мл с канюлей 30G) осторожно введите 50 - 80 мкл 0,25% Trypsin-EDTA в зажатый сегмент толстой кишки и инкубируйте в течение 10 мин. Оставьте канюлю и шприц прикрепленными к тефлоновой трубке, чтобы предотвратить обратное вытекание жидкости.
заметка: Толстая кишка должна быть раздута, чтобы разрушить слизистый барьер и достичь склепных стволовых клеток, но не слишком раздута, чтобы избежать перфорации зажатого сегмента.
- Сначала снимите дистальный зажим, а затем трипсиновую трубку.
- Промойте дистальный отдел толстой кишки ~ 500 мкл нормального физиологического раствора, чтобы удалить оставшийся трипсин.
- Вставьте новую тефлоновую трубку, установите дистальный зажим на место и надуйте сегмент толстой кишки 50 - 80 мкл аденовирусного раствора (1011 бляшечных единиц (БОЕ)/мл в фосфатно-солевом буфере) и инкубируйте в течение 30 минут (рис. 2A).
заметка: Не следует проливать вирусный раствор, так как контакт с адено-кре может привести к развитию опухоли в любой ткани условно мутантных мышей.
- Снимите зажимы и трубку.
- Закрытие брюшной полости и послеоперационное восстановление
- Закройте брюшную стенку 6-0 быстро рассасывающимися беговыми нитями (например, полидиоксаноном (PDS)).
- Закройте кожу хирургическими зажимами для раны.
- Поместите мышь на грелку, установленную на 38 °C, до полного восстановления от анестезии.
- Введите еще один болюс 0,05 мг/кг бупренорфина внутримышечно через 12 ч после операции, а затем дополнительные болюсы бупренорфина каждые 12 ч при необходимости.
- Наблюдайте за мышами не реже одного раза в день на предмет признаков дистресса, вызванного ростом опухоли.
2. Колоноскопия
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от используемых условных мутаций, аденовирусная инфекция приводит к эндоскопически видимым опухолям в течение 2-4 недель. Поэтому первую послеоперационную колоноскопию проводят через 2 недели после аденовирусной индукции и повторяют каждые 2 недели. Для колоноскопии мышей рекомендуется использовать коммерчески доступную систему.
- Подготовка животных к колоноскопии
заметка: Голодание не требуется. Оставшееся каловое вещество обычно хорошо формируется в дистальном отделе толстой кишки и может быть вытолкнуто за пределы опухоли во время колоноскопии, что делает стрессовый процесс повторного голодания ненужным.
- Используйте севофлуран в дозе 3 - 3,5 об.% для общей анестезии. Потеря рефлекса защемления пальца ноги свидетельствует о достаточной анестезии.
- Закройте глаза мышей, находящихся под наркозом, офтальмологической мазью, чтобы избежать высыхания роговицы.
- Удержите мышей в лежачем положении на небольшом столике.
- колоноскопия
- Введите эндоскоп (диаметр 1,9 мм; длина 10 см) в кишечный тракт через анальное отверстие и тщательно вдуйте воздух под визуальным контролем, чтобы расширить толстую кишку. Не вдыхайте больше воздуха, чем требуется для обследования.
заметка: Для инсуффляции воздуха можно использовать воздушный насос против запотевания колоноскопии системы. Если воздушный насос с защитой от запотевания недоступен, можно использовать любой другой воздушный насос с очень низкими настройками давления или нагнетать воздух с помощью деликатного редукционного клапана. Углекислый газ (CO2) легко приводит к ацидозу у мелких грызунов, поэтому его следует избегать.
- Осторожно продвигайте эндоскоп вперед до тех пор, пока не будет выявлено поражение слизистой оболочки в дистальном отделе толстой кишки (рисунок 1A - 1D).
- Сохраняйте эндоскопические изображения для последующей оценки. Эндоскопическая система оценки внутрипросветных опухолей была описана ранее.
- Осторожно снимите эндоскоп и положите мышь на грелку, установленную на 38 °C, пока она полностью не оправится от анестезии.
