1. Анализ, связывающий микротрубочки
- Для анализа связывания микротрубочек добавьте ~1 x 106 HCT 116 клеток в 100 мм чашки для культуры тканей, содержащие минимальную эссенциальную среду (MEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина. После одного дня культивирования клетки достигнут 60-70% слияния.
- Приготовьте 1X (2 мл) PEM буфер из 10X PEM буфера, хранящегося при 4 °C, добавив 20 мкМ (40 мкл) паклитаксела и 1 мМ (20 мкл) ГТФ. Возьмите запас микротрубочек (MT) из морозильной камеры при температуре -80 °C и рабочий запас E. coli tau из морозильной камеры при температуре -20 °C.
- Подготовьте образцы в соответствии с таблицей 1.
- Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин. Ультрацентрифуга при 25 °C в течение 60 мин при 100 000 x g.
- Перенесите 120 мкл надосадочной жидкости, содержащей несвязанный тау, в чистые и помеченные пробирки.
- Добавьте 120 мкл (того же объема, что и надосадочная жидкость) 5X буфера для проб в гранулу, содержащую связанный тау, и тщательно перемешайте. Перелейте раствор в чистые пробирки с этикеткой и тщательно перемешайте.
- Измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда с помощью коммерческих наборов для анализа белка.
заметка: При подготовке образцов используйте объем раствора (шаг 1.6) для приготовления образцов как пеллеты, так и надосадочной жидкости.
- Подготовьте образцы эквивалентной концентрации белка и добавьте свежеприготовленный 4x SDS буфер для загрузки геля, содержащий DTT (400 mM).
заметка: На этом этапе образцы могут храниться при температуре -20 °C.
- Инкубируйте образцы на нагревательном блоке при температуре 100 °C в течение 5 мин. Перемешайте образцы с помощью вортекса. Остудить при комнатной температуре ~10-15 минут.
- Соберите систему электрофореза для запуска 10% полиакриламидного геля с помощью SDS-PAGE.
- Загрузите 10 г белка (образец 13 мкл) в лунку в 10% полиакриламидный гель. Нагрузите лестницу с молекулярным грузом.
- После загрузки образца подключите положительный и отрицательный электроды системы электрофореза к источнику питания для поддержания постоянного напряжения. Первоначально начните с напряжения 70 В в течение 20 минут, чтобы переместить образцы белка из укладывающего геля в разрешающий гель. Затем увеличьте напряжение до 125 В и запустите гель примерно на 70-120 минут, пока образцы и белковая лестница не достигнут конца геля.
- После завершения электрофореза перенесите гель на мембрану из ПВДФ с помощью системы влажного электроблоттинга. Перенос в течение ~100 мин при 100 В.
- Отметьте кляксу, сделав небольшой надрез сбоку от молекулярной лестницы. Используйте прозрачный пластиковый лист и острый резак для резки кляксы.
- Заблокируйте мембрану в 4% буфере для блокировки BSA на 90 минут при комнатной температуре.
- Инкубируйте блот в растворе первичных антител (анти-тау в соотношении 1:5000) при температуре 4 °C в течение ночи. Промойте кляксу в PBST четыре раза, по 7 мин каждый.
- Приготовьте соответствующий раствор вторичных антител (козий IgG против мышей в соотношении 1:5000) и инкубируйте блот в течение 90 минут при комнатной температуре. Стирать в PBST четыре раза, по 7 мин каждый.
- Проявите блот с помощью набора для хемилюминесценции в соответствии с рекомендациями производителя. Накройте кляксу прозрачной полиэтиленовой пленкой. Получение изображений с помощью системы хемилюминесцентной визуализации для хемилюминесценции с помощью соответствующего программного обеспечения.
Таблица 1: Подготовка образцов для анализа на связывание микротрубочек.
| образец | имя | Необходимы микротрубочки | Основной необходимый белок | ПЭМ-GTP-PTX |
| 1 | HCT 116-Control (6,21 г/мкл) | 2 мкл | 9,66 мкл (60 мкг) | 108.34 μл |
| 2 | HCT 116-куркумин 10 μM (4,81 μг/μл) | 2 мкл | 16,63 мкл (80 мкг) | 101,37 мкл |
| 3 | HCT 116-куркумин 20 μМ (3,28 μг/μл) | 2 мкл | 30,49 μл (100 μг) | 87,51 мкл |
| 4 | HCT 116-LiCl 25 мМ (5,43 мкг/мкл) | 2 мкл | 18,42 мкл (100 мкг) | 99,58 мкл |
| 5 | Кишечная палочка тау | 2 мкл | 1 мкл тау-352 | 117 мкл |
| 6 | Только MT | 2 мкл | Х | 118 мкл |
| | | | 120 мкл каждый |
