Выделение ЦОК из образца цельной крови: метод получения ЦОК из модели колоректального рака у мышей

Аннотация

Источник: Kochall, S., et al. Выделение циркулирующих опухолевых клеток в ортотопической мышиной модели колоректального рака. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео описывает подробный протокол выделения циркулирующих опухолевых клеток из образца цельной крови модели мыши с усыпленной колоректальной опухолью. Эти выделенные ЦОК могут быть культивированы и использованы для предполагаемого последующего анализа.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Выделение циркулирующих опухолевых клеток из образцов цельной крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Получите кровь путем чрескожной пункции сердца у мышей, находящихся под наркозом, с последующей эвтаназией. В идеале 1000 μL крови набирается в шприц, предварительно заполненный 100 μL антикоагулянта (этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или гепарин). Используйте антитело против человеческого EpCAM (молекула адгезии эпителиальных клеток) для идентификации ЦОК. Это работает очень хорошо, если в мышиной модели используются линии эпителиальных клеток человека. Для других применений могут потребоваться другие антитела.

1. Обогащение КТК:
   1. Предварительно заполните пробирки объемом 15 мл средой градиента плотности 5 мл и осторожно переведите кровь в пробирку объемом 15 мл.
   2. Центрифугируйте (30 мин при 300 х г без тормоза) и осторожно удалите верхний надосадочный жидкость.
   3. Вылейте остаток в новую пробирку объемом 15 мл и центрифугуйте (15 минут, 300 x g с тормозом).
   4. Восстановите интерфазу, содержащую мононуклеарные элементы (выбросьте остальные) и дважды промойте клетки PBS.
   5. Повторно суспендируйте гранулу в 200 мкл PBS/1% ЭДТА и добавьте 4 мкл антитела EpCAM. Инкубировать 20 минут на льду в темноте.
2. Просеивание и комплектация
   1. Приготовьте следующий буфер (далее именуемый пикирующим буфером): PBS + 10% фетальная сыворотка теленка (FCS) + 1% пенициллин/стрептомицин (1%) + 0,8% ЭДТА.
   2. С помощью ручки PAP нарисуйте круг ~1 см в стерильной чашке Петри диаметром 6 см (предотвращает диспергацию жидкости в чашке) и нанесите в этот круг 700 μл буфера для сбора данных.
   3. Добавьте 50 мкл клеточной суспензии в 700 мкл пирингового буфера внутри круга. Проверьте плотность клеток с помощью микроскопа. Разделите образец на разные блюда, если он слишком плотный.
   4. Подождите, пока ячейки устаканятся (~5 мин).
   5. Проверьте каплю клеточной суспензии на наличие окрашенных (= EpCAM-положительных) клеток.
   6. После того, как клетка найдена, выберите ее с помощью микроманипулятора и поместите ее в буфер объемом 50 мкл в зависимости от предполагаемого последующего анализа (например, буфер для экстракции РНК или питательная среда).
   7. В зависимости от предполагаемых последующих анализов выделите EpCAM-отрицательные клетки и/или среду в качестве отрицательного контроля.
   8. Продолжайте последующие анализы (например, культивирование клеток, ПЦР).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Градиент плотности среды – Ficoll	Стволовые клетки - Лимфопреп	7801
Клон антител Alexa Fluor 488 против человека CD326 (EpCAM) 9C4	Биолегенда	No 324210 (Английский
Alexa Fluor 488 антимышиный клон CD326 (EpCAM) антитела G8.8	Биолегенда	No 118210
Чашка Петри, ø 60 x 15 мм, 21 см², вентиляционное отверстие	Грайнер биоуан	628102
Флуоресцентный микроскоп для клеточных культур	Лейка
Микроманипулятор Transferman 4r	Эппендорф
CellTram Air	Эппендорф		Аспирационный насос, подключенный к микроманипулятору
Универсальный съемник микроэлектродов Dmz	Корпорация Dagan		требуется для изготовления микрокапилляров для аспирации одиночных клеток
Призменные стеклянные капилляры	Корпорация Dagan
Ручка PAP	Абкам
Фосфатный буферный раствор Дульбекко	Компания «Лайф Текнолоджис ГмбХ	14190169	Отборочный буфер
Фетальная сыворотка теленка (FCS)	БИОХРОМ АГ	С 0115	Отборочный буфер
Пенициллин/стрептомицин (PenStrep)	Компания «Лайф Текнолоджис ГмбХ	15140122	Отборочный буфер
Эдта	Рот	8040.1	Отборочный буфер
Иммуногистохимия
Очищенный клон антител к человеку CD326 (EpCAM) 9C4	Биолегенда	324201	Иммуногистохимический анализ EpCAM
HRP кролик антимышиный IgG	Абкам	АБ97046	Иммуногистохимический анализ EpCAM

) » »