1. Органотипическая подготовка:
Приготовление органотипического геля, пропитанного фибробластами:
- Приготовьте суспензию клеток фибробластов, содержащую 5 x 105 клеток на органотипический продукт в DMEM с добавлением 10% FCS и 292 мкг/мл L-глютамина.
- Составляйте органотипические гели на льду в следующих соотношениях:
- • 7 объемов Rat-Tail Collagen: смесь Matrigel (1:1)
- • 1 том отфильтрованного 10x DMEM
- • 1 том ФТС
- • 1 объем суспензии клеток фибробластов, содержащей 5 x 105 фибробластов
Для 9 гелей (1 мл на гель) приготовьте 10 мл и аккуратно перемешайте, чтобы избежать образования пузырьков.
- Добавьте по 1 мл в каждую лунку 24-луночного планшета и инкубируйте в течение 1 часа при 37 °C во влажной атмосфере, чтобы гели застыли. Через 1 час добавьте 1 мл DMEM (10% FCS)/Glut поверх гелей и верните в инкубатор на ночь.
- На следующий день аспирируйте среду из верхней части гелей и нанесите 1 мл среды, содержащей 5 x 10-5 эпителиальных клеток CRC.
Подготовка нейлоновых листов с гелевым покрытием:
- Заранее подготовьте стерильные, автоклавные нейлоновые листы размером 1,5 см x 1,5 см.
- С помощью стерильных щипцов поместите необходимое количество капроновых листов в 10-сантиметровую чашку для культуры (обычно на одну чашку можно вместить 4 капроновых листа).
- Нанесите гель на лед в следующем порядке (на один лист нейлона требуется общий объем 250 μл):
- • 7 объемов коллагена Rat-Tail
- • 1 том отфильтрованного 10x DMEM
- • 1 том ФТС
- • 1 объем DMEM 10% FCS/Glut
- Если раствор желтого цвета, нейтрализуйте, добавив 0,1 М NaOH в 50 мкл аликвот до тех пор, пока раствор не станет розовым.
- Добавьте 250 μл этого раствора в каждый нейлоновый лист и инкубируйте при 37 °C во влажной атмосфере с 5%CO2 в течение 30 минут, чтобы гель схватился.
- Макияж 1% раствор глутаральдегида в PBS. Добавьте по 10 мл в каждую 10-сантиметровую чашку для посева, как только гель застынет, и выдерживайте при 4 °C в течение 1 часа.
- Постирайте нейлоновые простыни 3 раза в PBS и 1 раз в DMEM (10% FCS)/Glu и выдержите в течение ночи в DMEM/Glu при 4 °C.
Подъем органотипических гелей на стальные решетки для инвазии:
- Заранее подготовьте решетки строительных лесов, сложив листы нержавеющей стали в форму штатива. Автоклав перед использованием.
- С помощью щипцов, стерилизованных в этаноле, поместите стальную сетку в каждую лунку шестилуночной пластины.
- Поместите на каждую сетку нейлоновый лист с гелевым покрытием коллагеновой стороной вверх.
- Осторожно перенесите органотипические гели с 24-луночного планшета на рельефный нейлоновый лист с помощью стерилизованного в этаноле шпателя.
- Заполните лунку DMEM 10% FCS/Glut с добавлением 10% FCS до тех пор, пока нейлоновый лист не соприкоснется со средой, но не будет погружен в воду. Следите за тем, чтобы средство не соприкасалось с органотипическим гелем.
- Инкубировать в течение 14 дней при 37 °C во влажной атмосфере с содержаниемCO2 5%, заменяя среду каждые 2 дня.
2. Органотипическая фиксация
- Удалите весь органотипический лист, включая капроновый лист, из колодца и поместите на пищевую пленку.
- Рассеките органотипный и нейлоновый лист пополам с помощью чистого одноразового скальпеля и зафиксируйте обе половинки в формальдегиде на 24 часа при комнатной температуре.
- Замените формальдегид на 70% этанол через 24 часа и оставьте на ночь перед заделкой в парафин, разрезанием и окрашиванием.
3. Лазерная микродиссекция инвазивного края
- Сечение толщиной до 10 мкм на предметные стекла, установленные на мембране.
- Депарафинизируйте срезы, нанеся ксилол на 1 минуту, затем удалите ксилол и закрепите 75% этанол еще на 1 минуту.
- Удалите этанол и морните 0,125% раствором Cresyl Violet в течение 1 мин. Cresyl Violet выделяет эпителиальные клетки и позволяет легко отделить их от стромы.
- Удалите Cresyl Violet и нанесите 100% этанол еще на 1 минуту, прежде чем смыть 100% этанолом. Дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе в течение 30 минут.
- Провести лазерную микродиссекцию с помощью выбранной платформы (например, системы Leica AS).
- Поместите предметное стекло витражной частью для микродисперсии лицевой стороной вниз на предметный столик микроскопа.
- Установите микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл в кассету для сбора и добавьте 50 мкл буфера для лизиса клеток (например, ДНК, РНК или буфера для лизиса белка) в колпачок, в который будет собираться микрорассекированная ткань.
- Находясь под прямым зрением, используйте джойстик, чтобы определить интересующую ткань. С помощью программного интерфейса аннотируйте окрашенный органический участок, выделяя клетки, подлежащие микродиссекции, на фронте инвазии опухоли.
- Дайте команду лазеру выстрелить, который должен одновременно вырезать выделенный участок и продвинуть микрорассеченную ткань в колпачок микроцентрифужной трубки.
- Как только будет собрано достаточное количество материала, извлеките кассету для сбора, закройте микроцентрифужную пробирку и осторожно вращайте, чтобы втянуть буфер для лизиса на дно пробирки.
- Поместите образцы на лед до завершения микродиссекции. Обрабатывайте образцы подходящим методом для извлечения интересующего аналита.
