Анализ тракционной цитометрии: метод количественной оценки силы тракции, оказываемой раковыми клетками на ЭКМ

Аннотация

Источник: Ali, M. Y., et al. Выделение клеток первичной опухоли толстой кишки человека из хирургических тканей и культивирование их непосредственно на мягких эластичных субстратах для тракционной цитометрии. J. Vis. Exp. (2015).

В этом видео описывается микроскопия силы вытяжения. Анализ определяет клеточное тракционирование клеток рака толстой кишки человека на внеклеточном матриксе, присутствующем на мягком эластичном гидрогеле с внедренными флуоресцентными шариками. Результирующее смещение флуоресцентных шариков измеряется с помощью соответствующего программного обеспечения.

Протокол

1. Микроскопический анализ силы тяги

1. Нагрейте 0,25% раствор трипсина-ЭДТА/10% SDS при 37 °C на водяной бане в течение 10 минут перед началом экспериментов по вытяжению.
2. Извлеките по одному гелю (Функционализируйте гели PA и стекло с молекулами ECM, человеческим фибронектином в концентрации 50 мкг/мл) из инкубатора для клеточных культур в нужное время и поместите на предметный столик флуоресцентного инвертированного микроскопа (32-кратное увеличение).
3. Найдите одну ячейку в поле зрения. Снимите крышку чашки Петри.
4. Сделайте фазово-контрастное изображение клетки (например, рис. 1).
5. Переключите режим визуализации на флуоресцентный и выберите подходящий фильтр. Не перемещайте предметный столик или образец микроскопа в течение этого времени.
6. Сделайте изображение флуоресцентных шариков, вытесненных клеточной тракцией (рис. 2C).
7. Добавьте 1 мл раствора трипсина/SDS в чашку Петри, чтобы отделить клетку от геля. Не перемещайте предметный столик или образец микроскопа в течение этого времени. Также сделайте контрольное изображение клетки, чтобы обеспечить полное удаление из геля.
8. Возьмите эталонное изображение (нулевое усилие) бусин после удаления ячейки.
9. Повторите шаги 1.2-1.8 для всех остальных гелей.
10. Создайте стек изображений с помощью ImageJ из двух изображений, полученных на шагах 1.6 и 1.8 для каждого случая. Чтобы создать стек изображений, используйте следующую последовательность команд в ImageJ после открытия изображений: Image → Stacks → Images to stack.
11. Чтобы получить поле смещения и тягу, используйте плагины ImageJ, следующие опубликованным методам. Получите коды и подробные инструкции для этих плагинов по следующей ссылке: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
    1. Выровняйте изображения в стеке с помощью плагина «Сопоставление шаблонов». Используйте следующую последовательность команд в ImageJ после открытия стека изображений, сгенерированного на шаге 1.10: Плагины → Сопоставление шаблонов → Выравнивание срезов в стеке → OK. Сохраните стек изображений соответственно. Используйте этот новый стек изображений в следующих шагах.
    2. Получите поле смещения с помощью плагина PIV (particle image velocimetry) (рисунок 2D). Используйте следующую последовательность команд после открытия стека изображений, сохраненного на шаге 1.11.1: Плагины → PIV → Итеративный PIV (Basic) → OK → Принять этот PIV и вывести → OK. Сохраните вывод PIV в той же директории, что и в исходном стеке изображений. Используйте это в качестве входных данных на следующем шаге.
    3. Наконец, используйте плагин FTTC (тракционная цитометрия с преобразованием Фурье) для получения тракционной карты (рис. 2E). Используйте следующую последовательность команд: Плагины → FTTC → Вставьте свойства материала, т.е. модуль Юнга и отношение Пуассона геля PA → OK → Выберите выходной файл PIV, сохраненный на шаге 1.11.2, → OK. Сохраните результаты FTTC в той же директории, что и в стеке изображений и выходе PIV.

Результаты

Рисунок 1. Успешная культура первичных клеток толстой кишки человека (как раковых, так и нормальных) на гелях различной жесткости и на полистирольной чашке. Фазово-контрастные изображения показывают типичную морфологию (А) опухолевых клеток и (В) нормальных клеток на подложках различной жесткости.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ПБС	Лонза	17-516Ф
трипсин	Уортингтон	LS003736
Акриламид	Сигма-Олдрич	А4058
N-метиленбисакриламид (бис)	Сигма-Олдрич	М1533
Фибронектин человека	BD бионауки	354008
0,1 μм флуростирующие шарики	Технологии жизни	Ф8801
0,25% Трипсин-ЭДТА	Технологии жизни	No 25200-056
Стеклянные крышки 12 мм2	Корнинг	2865-12

гг.