Анализ цитоскелета и организации фокальной адгезии: иммунофлуоресцентный метод изучения клеточной адгезии и распространения на субстратах

Аннотация

Источник: Ali, M. Y et al., Выделение клеток первичной опухоли толстой кишки человека из хирургических тканей и культивирование их непосредственно на мягких эластичных субстратах для тракционной цитометрии. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео описывает технику изучения цитоскелета и фокальных спаек в первичных клетках рака толстой кишки человека, чтобы понять его вариации в зависимости от жесткости субстрата. Эта культура раковых клеток на мягких и твердых субстратах позволяет проводить различные биофизические измерения для прогнозирования рака.

Протокол

1. Иммунофлуоресцентная микроскопия

1. Возьмите субстраты с клетками, подлежащими иммуноокрашиванию, к ламинарному колпаку и удалите питательные среды.
2. Промойте субстраты PBS и зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом в PBS на 20 мин при RT.
3. Промойте основания PBS три раза (каждый раз по 5 минут). Затем инкубируйте субстраты с усилителем сигнала 500 мкл в течение 30 минут и промойте PBS.
4. Инкубировать клетки с моноклональным антителом к винкулину в разведении 1:250 в PBS в течение 45 мин при ЛТ. Затем промойте основания PBS 3 раза (каждый раз по 5 минут).
5. Инкубируйте образцы с вторичным антителом Alexa Fluor 488 козьего антимышиного IgG в разведении 1:200 в PBS при RT в течение 30 мин. Промойте субстраты PBS 3 раза (каждый раз по 5 мин).
6. Чтобы визуализировать структуру F-актина, инкубируйте клетки с конъюгатами фаллоидина TRITC в концентрации 50 мкг/мл в течение 45 мин при ЛТ. Затем промойте основания PBS 3 раза (каждый раз по 5 минут).
7. Визуализируйте образцы с помощью конфокального сканирующего лазерного микроскопа (рис. 1A-1D).

Результаты

Рисунок 1. Иммунофлуоресцентное окрашивание F-актина и винкулина на мягких гелевых и твердых полистирольных подложках.Актиновое волокно не присутствовало в менее распространенных (А1) опухолевых клетках или (А2) нормальных клетках на мягких гелях с массой 2 кПа. Тем не менее, точечные винкулинсодержащие фокальные спайки присутствуют на мягких гелевых

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагентов
ПБС	Лонза	17-516Ф
Параформальдегид	Науки электронной микроскопии	RT15710
Усилитель сигнала	Технологии жизни	И36933
Моноклональные антитела против винкулина	Сигма-Олдрич	В9131
Alexa Fluor 488 козий антимышиный IgG	Технологии жизни	А11001
Конъюгаты фаллоидина TRITC	Сигма-Олдрич	С1951
материалы
Стеклянные крышки 12 мм2	Корнинг	2865-12

гг.