Подготовка блоков замороженной кожной ткани: протокол сохранения образцов меланомы кожи мышей

Аннотация

Источник: Moon, H., et al. Пространственный и временной контроль инициации меланомы мышей из мутантных стволовых клеток меланоцитов. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео подробно описан протокол выделения меланомы, содержащей спинную кожу мышей, с последующим криовстраиванием для подготовки замороженного блока кожной ткани. Криозалитый тканевый блок может быть разрезан и исследован под микроскопом для изучения прогрессирования меланомы.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Обработка тканей

1. Изоляция кожи
   1. Перед началом работы приобретите: инструменты для вскрытия, фильтровальную бумагу и бумажные полотенца.
   2. Усыпьте мышей в соответствии с утвержденными протоколами и подтвердите смерть, прежде чем продолжить.
   3. С помощью машинки для стрижки волос сбрейте все волосы на тыльной стороне кожи. Слегка почистите участок безворсовой салфеткой, чтобы очистить область.
   4. Сделайте небольшой надрез острыми ножницами чуть выше основания хвоста.
   5. Вставьте большие тупые ножницы в разрез и отделите подкожные соединительные ткани.
   6. Аккуратно изолируйте интересующий участок кожи, разрезав острыми ножницами по краю ткани.
   7. Положите кожную салфетку на чистое бумажное полотенце и с помощью тупых щипцов растяните кожу так, чтобы она прилегала к полотенцу и была натянутой. Этот шаг служит для обеспечения дополнительной поддержки ткани, чтобы ею можно было манипулировать и обрабатывать с сохранением ее формы.
      заметка: Будьте осторожны и обрабатывайте только внешние участки кожной ткани, так как щипцы могут вызвать повреждение кожи, которое может быть видно гистологически.
2. Фиксация тканей
   1. Сложите лист фильтровальной бумаги пополам и наклейте соответствующую этикетку. Поместите кожу вместе с подложкой из бумажного полотенца в сложенную бумагу, непосредственно прилегающую к складке, следя за тем, чтобы образец был гладким, а не сложенным или скомканным. Запечатайте фильтровальную бумагу, скрепив открытые стороны, а затем обрежьте так, чтобы оставшуюся бумагу можно было использовать для будущих образцов.
      заметка: Этот этап выполняется для того, чтобы кожа сохранила свою форму во время фиксации.
   2. Полностью погрузите образец ткани в 10% нейтральный буферизованный формалин на 3–5 часов при комнатной температуре или на ночь при 4 °C.
   3. После фиксации извлеките образцы из формалина, промойте в деионизированной воде (2 x 5 мин каждый) и приступайте к изготовлению тканевых блоков. Осторожно удалите остатки материала из тканей кожи (т. е. остатки бумаги).
3. Изготовление блоков замороженных тканей (Рисунок 1)
   1. Обрежьте края образца кожи так, чтобы они не были зазубренными, а затем сделайте 3 сагиттальных надреза. Ширина этих полосок не должна быть больше высоты криомолда (5 мм). Далее сделайте поперечные надрезы, чтобы получились кусочки кожи, которые не длиннее ширины криомолда (20 мм) и могут быть заделаны. Повторите то же самое с оставшейся половиной кожи тыльной стороны или сохраните ткань для других целей (в качестве альтернативы сохраните половину до фиксации).
      заметка: Важно, чтобы кусочки кожи находились в правильной ориентации.
   2. Расположите криомолд (25 x 20 x 5 мм³) в портретной ориентации и поместите от 4 до 5 кусочков кожи поверх ОКТ. Когда все части будут на своих местах, используйте 2 пары тонких щипцов, чтобы довести длинный край кожи до дна криоформы. Теперь кожа должна стоять в ОКТ перпендикулярно основанию формы. Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму образование воздушных карманов внутри ОКТ на этом этапе (Рисунок 1).
   3. Заполните форму ОКТ до второй кромки, и поместите ее на плоскую поверхность сухого льда. С помощью щипцов отрегулируйте все участки кожи, которые могли сместиться во время переноса, когда блок начинает замерзать. Как только нижний слой застынет, манипуляции с тканями станут невозможными.
   4. Вырежьте слайды размером 8-10 мкм для анализа.
4. Изготовление блоков ткани с фиксированным парафином формалином (FFPE)
   1. Поместите 2 кусочка неподвижной кожи в маркированную кассету и обезвоживайте в возрастающих концентрациях этанола (75% этанола в течение 30 мин, 85% в течение 30 мин, 90% в течение 30 мин, 95% в течение 30 мин, 100% в течение 2x 30 мин, ксилола или заменителя ксилола в течение 2x 30 мин). Выдерживать с парафином при температуре 58-60°С, сначала в течение 30 минут, а затем на ночь.
   2. Поместите салфетку в форму для салфеток из нержавеющей стали²⁴ x 24 мм с жидким парафином и затвердейте при -5 °C. Ориентация тканей должна быть аналогична ориентации замороженных тканевых блоков, чтобы можно было визуализировать продольные срезы нескольких волосяных фолликулов (рис. 1).
   3. Как только парафин застынет, снимите форму и разрежьте ее на участки размером 5-10 мкм для анализа.

Результаты

Рисунок 1: Выделение тканей кожи и криовстраивание. После эвтаназии побрейте интересующую область кожи мыши на тыльной стороне и внедрите кожу в криомолд, содержащий ОКТ. Пунктирная линия на мыши представляет собой среднюю линию. Как правило, 3 или 4 куска кожи могут быть изолированы отрезком линии 3-4 по средней линии; Одна такая фигура обозначена прямоугольником 1/2/3/4. Эти кусочки кожи должны быт...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Триммер для шерсти домашних животных	Валь	09990-502 (Английский)
Крем для эпиляции	Наир	н/д	Доступно в большинстве аптек
Ватные палочки	различный
Ультрафиолетовая лампочка	УВП	95-0042-08	модель XX-15M УФ-лампа среднего уровня
Этанол 200 пробы	различный		чистый этанол
Гистопласт ЧП	Научный центр Фишера	22900700	Парафиновые гранулы
Нейтральный буферизованный формалин, 10%	сигма	HT501128-4л
Компаунд O.C.T.	термо	23730571
Кассета для салфеток	Сакура	89199-430	для обработки FFPE
Криоформы	Сакура	4557	25 x 20 мм
Металлическая форма FFPE	Лейка	3803082	24 мм x 24 мм
Изофлуран	различный		Ветеринарный класс
Система ингаляций для анестезии	различный		Ветеринарный класс
Тонкие ножницы	ФСТ	14085-09	Прямой, острый/острый
Тонкие ножницы	ФСТ	14558-09	Прямой, острый/острый
Щипцы	ФСТ	11252-00	Дюмон #5
Щипцы	ФСТ	11018-12	Микро-Адсон
Тир-КреЕР; LSL-BrafV600E; Pten f/f	Лаборатории Джексона	No 13590
LSL-tdTomato	Лаборатории Джексона	7914	АИ14