Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Обработка опухолевой ткани для имплантации мышей
- Хирургическое иссечение или хирургическая биопсия ткани
- Перенесите ткань в стерильную чашку Петри и максимально отделите опухолевую ткань от окружающих нормальных тканей.
- Удалите некротическую ткань (обычно идентифицируемую как бледно-белесая ткань, расположенную в центре опухоли) из оставшейся опухоли, насколько это возможно.
- С помощью скальпеля разделите начальный фрагмент опухоли на примерно равные части (~3 мм x 3 мм) для хирургической имплантации мыши (Рисунок 1).
- При необходимости, если имеется достаточное количество опухолевой ткани, заморозьте ткань для последующих анализов (секвенирование РНК [RNASeq], полноэкзомное секвенирование [WES] и т. д.).
- Сделайте опухолевую суспензию, измельчив опухолевую ткань с помощью техники крестообразного лезвия с двумя лезвиями скальпеля. Измельчите кусочки опухоли как можно мельче, чтобы образовалась суспензия, которая теперь готова к хирургической имплантации мыши.
- В качестве альтернативы, если опухолевая ткань слишком тверда для механической диссоциации, используйте процедуру диссоциации пищеварения для формирования гелеобразной суспензии и одноклеточной суспензии для имплантации и/или инъекции.
- Измельчите кусочки опухоли как можно мельче, чтобы образовалась кашица.
- Поместите суспензию в пробирку объемом 50 мл с холодным сбалансированным раствором соли Ганка (HBSS)-/- (без Ca++ и Mg++); затем центрифугируйте гранулу при 220 x g в течение 4 минут при 4 °C.
- Суспендируйте суспензию в 10 мл подогретой свежей среды для разложения (200 Ед/мл коллагеназы в/в + 5 мМ CaCl2 + 50 Ед/мл ДНКазы в HBSS-/-) на 1 г опухолевой ткани.
- Поместите трубку на водяную баню при температуре 37 °C на 20 минут и энергично перемешивайте каждые 5 минут с помощью одноразовой пипетки.
- Промойте до 50 мл HBSS-/-; затем центрифугируйте при 220 x g в течение 4 минут при 4 °C.
- Добавьте 5 мл предварительно подогретого TEG (0,025% трипсина + 40 мкг/мл этиленгликоля-биса (β-аминоэтилового эфира)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты [EGTA] + 10 мкг/мл поливинилового спирта [PVA]) на 1 г опухолевой ткани, аккуратно подсушите/встряхните и поместите пробирку при температуре 37 °C на 2 минуты, не перемешивая.
- Добавьте не менее 1 равного объема среды для холодного окрашивания (1% бычьего сывороточного альбумина [BSA] + 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты [HEPES] + 1x пенициллин-стрептомицин в среде L15) для гашения трипсина и центрифугируйте при 220 x g в течение 4 минут при 4 °C.
- Повторно суспендируйте образец в 10 мл красящей среды на 1 г опухолевой ткани и отфильтруйте его через клеточное сетчатое фильтр 40 мкм, чтобы получить суспензию одиночных клеток для инъекции мышей (рис. 1).
- Суспензия, оставшаяся на поверхности клеточного фильтра, также может быть собрана для хирургической имплантации мыши.
- Имплантация опухоли и инъекция мышам
- Имплантация хирургического иссечения или хирургической биопсии ткани
заметка: Убедитесь, что все хирургические инструменты стерильны путем автоклавирования или использования предварительно стерилизованных одноразовых инструментов.
- Сбрейте шерсть с нижней части спины NSG за 6-8 недель до самцов или самок мышей, оставив участок размером примерно 1,5 см х 3 см без волос. Обезболите мышей с помощью изофлурана и подтвердите, осторожно сдавливая ногу в качестве теста на реакцию. Используйте ветеринарную мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость.
- Поместите отдельных мышей на грелку в носовой конус наркозного аппарата, протрите выбритый участок хлоргексидином. Затем облейте 70% этанолом и дайте ему испариться.
- Приготовьте куски или разделите опухолевую суспензию в чашке Петри на отдельные холмики для хирургической имплантации (т.е. на три равных холмика, если они будут имплантированы 3 мышам).
- С помощью лезвия скальпеля сделайте надрез длиной примерно 5 мм по центру тыльной стороны мыши, возьмите одну пару щипцов и приподнимите кожу вверх со стороны разреза, противоположной оператору.
- Возьмите ножницы в другую руку и отделите кожу от мышечного слоя, аккуратно разрезав фасциальную оболочку небольшими ножницеобразными надрезами, тем самым создав «карман» для опухолевой ткани.
- Возьмите лезвием скальпеля один кусок опухоли или один отдельный холмик ткани опухолевой суспензии и аккуратно поместите ткань в созданный карман.
- Введите 100 мкл искусственного внеклеточного матрикса на холмик опухолевой ткани в кармане.
- С помощью двух пар щипцов подтяните разрез с обоих концов так, чтобы края раны приблизились друг к другу, и закройте рану, наложив один или два зажима для раны.
- Подкожно вводите 1-5 мг/кг мелоксикама в качестве анальгетика мышам после операции.
- Выньте мышь из носового конуса и поместите ее обратно в исходную клетку; наблюдайте за мышью, когда она просыпается. Не возвращайтесь в клетку до полного выздоровления.
- Снимите зажимы для раны примерно через 7 дней. Если заживление не завершилось через 7 дней, оставьте зажим для раны еще на один или два дня.
заметка: При использовании суспензии одиночных клеток после хирургического иссечения или обработки тканей методом хирургической биопсии, она будет смешиваться с искусственным внеклеточным матриксом (в соотношении 1:1) для инъекции мышам.
- Инъекция FNA или биопсия ткани кора
- Поместите мышь NSG на стойку из стальной решетки, крепко держите мышь за хвост и осторожно потяните мышь назад. Он будет крепко держаться за решетку передними ногами. В качестве альтернативы можно задержать мышь в недоминирующей руке и сделать область фланга видимой.
- Продезинфицируйте кожу пашины с помощью спиртовых тампонов. Медленно и неуклонно вводите содержимое шприца под кожу мыши.
- Вытащите иглу и поместите мышь обратно в клетку.
- Мониторинг роста опухоли
- Наблюдайте за мышами один раз в неделю, чтобы проверить наличие пальпируемых опухолей.
- Как только опухоль достигнет измеримого размера (примерно 50мм3), используйте штангенциркуль для записи размеров опухоли. Используйте следующую формулу для расчета объема опухоли: (ширина х ширина х длина) / 2.
- Удаляйте опухоль, как только объем опухоли достигнет около 1,5 см3 (примерно 4-10 недель). Опухоль теперь называется мышиным пассажем 1 (MP1).
