Моделирование ксенотрансплантата, полученного от пациента: метод создания мышиных моделей меланомы

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Обработка опухолевой ткани для имплантации мышей

1. Хирургическое иссечение или хирургическая биопсия ткани
   1. Перенесите ткань в стерильную чашку Петри и максимально отделите опухолевую ткань от окружающих нормальных тканей.
   2. Удалите некротическую ткань (обычно идентифицируемую как бледно-белесая ткань, расположенную в центре опухоли) из оставшейся опухоли, насколько это возможно.
   3. С помощью скальпеля разделите начальный фрагмент опухоли на примерно равные части (~3 мм x 3 мм) для хирургической имплантации мыши (Рисунок 1).
   4. При необходимости, если имеется достаточное количество опухолевой ткани, заморозьте ткань для последующих анализов (секвенирование РНК [RNASeq], полноэкзомное секвенирование [WES] и т. д.).
   5. Сделайте опухолевую суспензию, измельчив опухолевую ткань с помощью техники крестообразного лезвия с двумя лезвиями скальпеля. Измельчите кусочки опухоли как можно мельче, чтобы образовалась суспензия, которая теперь готова к хирургической имплантации мыши.
   6. В качестве альтернативы, если опухолевая ткань слишком тверда для механической диссоциации, используйте процедуру диссоциации пищеварения для формирования гелеобразной суспензии и одноклеточной суспензии для имплантации и/или инъекции.
      1. Измельчите кусочки опухоли как можно мельче, чтобы образовалась кашица.
      2. Поместите суспензию в пробирку объемом 50 мл с холодным сбалансированным раствором соли Ганка (HBSS)^-/- (без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺); затем центрифугируйте гранулу при 220 x g в течение 4 минут при 4 °C.
      3. Суспендируйте суспензию в 10 мл подогретой свежей среды для разложения (200 Ед/мл коллагеназы в/в + 5 мМ CaCl₂ + 50 Ед/мл ДНКазы в HBSS-^/-) на 1 г опухолевой ткани.
      4. Поместите трубку на водяную баню при температуре 37 °C на 20 минут и энергично перемешивайте каждые 5 минут с помощью одноразовой пипетки.
      5. Промойте до 50 мл HBSS^-/-; затем центрифугируйте при 220 x g в течение 4 минут при 4 °C.
      6. Добавьте 5 мл предварительно подогретого TEG (0,025% трипсина + 40 мкг/мл этиленгликоля-биса (β-аминоэтилового эфира)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты [EGTA] + 10 мкг/мл поливинилового спирта [PVA]) на 1 г опухолевой ткани, аккуратно подсушите/встряхните и поместите пробирку при температуре 37 °C на 2 минуты, не перемешивая.
      7. Добавьте не менее 1 равного объема среды для холодного окрашивания (1% бычьего сывороточного альбумина [BSA] + 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты [HEPES] + 1x пенициллин-стрептомицин в среде L15) для гашения трипсина и центрифугируйте при 220 x g в течение 4 минут при 4 °C.
      8. Повторно суспендируйте образец в 10 мл красящей среды на 1 г опухолевой ткани и отфильтруйте его через клеточное сетчатое фильтр 40 мкм, чтобы получить суспензию одиночных клеток для инъекции мышей (рис. 1).
      9. Суспензия, оставшаяся на поверхности клеточного фильтра, также может быть собрана для хирургической имплантации мыши.
2. Имплантация опухоли и инъекция мышам
   1. Имплантация хирургического иссечения или хирургической биопсии ткани
      заметка: Убедитесь, что все хирургические инструменты стерильны путем автоклавирования или использования предварительно стерилизованных одноразовых инструментов.
      1. Сбрейте шерсть с нижней части спины NSG за 6-8 недель до самцов или самок мышей, оставив участок размером примерно 1,5 см х 3 см без волос. Обезболите мышей с помощью изофлурана и подтвердите, осторожно сдавливая ногу в качестве теста на реакцию. Используйте ветеринарную мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость.
      2. Поместите отдельных мышей на грелку в носовой конус наркозного аппарата, протрите выбритый участок хлоргексидином. Затем облейте 70% этанолом и дайте ему испариться.
      3. Приготовьте куски или разделите опухолевую суспензию в чашке Петри на отдельные холмики для хирургической имплантации (т.е. на три равных холмика, если они будут имплантированы 3 мышам).
      4. С помощью лезвия скальпеля сделайте надрез длиной примерно 5 мм по центру тыльной стороны мыши, возьмите одну пару щипцов и приподнимите кожу вверх со стороны разреза, противоположной оператору.
      5. Возьмите ножницы в другую руку и отделите кожу от мышечного слоя, аккуратно разрезав фасциальную оболочку небольшими ножницеобразными надрезами, тем самым создав «карман» для опухолевой ткани.
      6. Возьмите лезвием скальпеля один кусок опухоли или один отдельный холмик ткани опухолевой суспензии и аккуратно поместите ткань в созданный карман.
      7. Введите 100 мкл искусственного внеклеточного матрикса на холмик опухолевой ткани в кармане.
      8. С помощью двух пар щипцов подтяните разрез с обоих концов так, чтобы края раны приблизились друг к другу, и закройте рану, наложив один или два зажима для раны.
      9. Подкожно вводите 1-5 мг/кг мелоксикама в качестве анальгетика мышам после операции.
      10. Выньте мышь из носового конуса и поместите ее обратно в исходную клетку; наблюдайте за мышью, когда она просыпается. Не возвращайтесь в клетку до полного выздоровления.
      11. Снимите зажимы для раны примерно через 7 дней. Если заживление не завершилось через 7 дней, оставьте зажим для раны еще на один или два дня.
          заметка: При использовании суспензии одиночных клеток после хирургического иссечения или обработки тканей методом хирургической биопсии, она будет смешиваться с искусственным внеклеточным матриксом (в соотношении 1:1) для инъекции мышам.
   2. Инъекция FNA или биопсия ткани кора
      1. Поместите мышь NSG на стойку из стальной решетки, крепко держите мышь за хвост и осторожно потяните мышь назад. Он будет крепко держаться за решетку передними ногами. В качестве альтернативы можно задержать мышь в недоминирующей руке и сделать область фланга видимой.
      2. Продезинфицируйте кожу пашины с помощью спиртовых тампонов. Медленно и неуклонно вводите содержимое шприца под кожу мыши.
      3. Вытащите иглу и поместите мышь обратно в клетку.
3. Мониторинг роста опухоли
   1. Наблюдайте за мышами один раз в неделю, чтобы проверить наличие пальпируемых опухолей.
   2. Как только опухоль достигнет измеримого размера (примерно 50^мм3), используйте штангенциркуль для записи размеров опухоли. Используйте следующую формулу для расчета объема опухоли: (ширина х ширина х длина) / 2.
   3. Удаляйте опухоль, как только объем опухоли достигнет около 1,5 см³ (примерно 4-10 недель). Опухоль теперь называется мышиным пассажем 1 (MP1).

Рисунок 1: Альтернативные методы имплантации.(А) Опухоли могут быть переработаны либо в куски, либо в виде суспензии в виде суспензии в виде одноклеточной суспензии. (Б) Все три метода позволяют выращивать опухоли in vivo. На снимке изображены мыши, которым подкожно имплантировали опухоль и сделали снимки через 12 дней после имплантации. (C) Показаны кривые роста опухоли у мышей, которым вводили один из трех методов имплантации. N = 5 на плечо; Полосы ошибок являются стандартными ошибками.