Метод висячей капли: техника получения 3D сфероидов меланомы

1. Генерация сфероидов 3D меланомы методом висячей капли

1. Культивирование клеток меланомы (например, 451-LU или любой представляющей интерес клеточной линии меланомы) в соответствии с общими протоколами, используя RPMI, содержащий 10% FCS.
   1. Чтобы получить сфероиды меланомы аналогичного размера и качества, промойте клетки меланомы в PBS, добавьте 5 мл 1x Trypsin-EDTA в PBS в клетки в колбе для клеточных культур T175 и инкубируйте в течение 3-5 минут при комнатной температуре (RT). Нейтрализуйте трипсин, добавив 5 мл RPMI/10% FCS. Соберите клетки центрифугированием при 200 x g в течение 5 минут. Ресуспендируйте клеточную таблетку в RPMI/FCS при конечной концентрации 10 000 клеток/мл, определенной путем подсчета в гемоцитометре.
2. Нанесите 40 x 25 μL (= 250 клеток) клеточной суспензии на внутреннюю поверхность крышки стерильной неадгезивной чашки для клеточных культур (Ø 10 см) с помощью электронной мультипипетки. Быстрым, но плавным движением поверните крышку и поместите ее на соответствующую чашку для клеточных культур, содержащую 5 мл PBS.
   1. Культивирование «подвесных капельных чашек» в клеточном инкубаторе при 37 °С и 5%_СО2 в течение 10-14 дней, в зависимости от типа используемой клетки><. заметка: Клетки из фазы роста метастатической меланомы обычно растут быстрее и образуют более твердые сфероиды в висячей капле по сравнению с клетками меланомы, полученными из радиальной фазы роста или вертикальной фазы роста. Для индивидуальной оценки наблюдайте за ростом сфероидов под биноклем или под световым микроскопом (4-кратное увеличение). Обычно сфероиды становятся обнаруживаемыми через 48 часов под биноклем или под световым микроскопом (4-кратное увеличение). Через 10-14 дней они видны без какого-либо устройства увеличения.
3. Через пять дней после появления первых кровянистых выделений добавьте 10 μL свежей среды RPMI/10% FCS в каждую каплю. Впоследствии меняйте 10 мкл среды через день. Использование электронного дозатора очень полезно на этом этапе.
4. В зависимости от типа клеток, собирают сфероиды через 10-15 дней. Тщательно промойте сфероиды с крышки подвесной чашки для культивирования капель клеток с помощью PBS. Соберите 10-20 сфероидов в стерильную неадгезивную чашку для клеточных культур. Осторожно удалите излишки PBS с помощью пастеровской пипетки.
   заметка: Период культивирования зависит от фазы роста опухоли клеток меланомы в момент их первоначального получения, например, сфероиды, полученные из клеток 451-LU, вырастают примерно до 500 мкм в диаметре в течение 12 дней после культивирования в висячей капле.