Создание органотипических полнокожных реконструкций: процедура создания 3D-модели кожи с использованием образцов кожи человека

Аннотация

Источник: Müller, I. et al. 3D органотипическая модель сфероидальной кожи меланомы. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео подробно описывается протокол создания in vitro 3D органотипических реконструкций кожи для изучения прогрессирования меланомы. Эта модель кожи имитирует как архитектуру, так и многоклеточную сложность органов in vivo.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Выделение первичных кератиноцитов из эпидермиса

1. Промойте эпидермальную ткань PBS. Разрежьте эпидермис на более мелкие кусочки (1 мм²) и соберите их в коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте 10 мл 1x Trypsin-EDTA (предварительно нагретый до 37 °C) и выдерживайте в течение 5 минут на водяной бане при 37 °C. Делайте вихревой тканевый раствор каждые 2 минуты.
2. Остановите ферментативную реакцию, добавив 1 мл фетальной сыворотки теленка (СКС). Ресуспендируйте клетки путем пипетирования вверх и вниз с помощью пластиковой пипетки объемом 10 мл в течение 4 минут. Старайтесь избегать образования пузырей и пены.
3. Пипетируйте клеточную суспензию в клеточное ситечко (размер пор 100 мкм), помещенное поверх свежей конической пробирки объемом 50 мл, и промойте 3 раза 5 мл PBS. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 минут. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 2-6 мл питательной среды, содержащей 1% (v/v) гентамицина. Определите количество клеток вручную, подсчитав клетки в гемоцитометре, и засейте 6 x 10⁵ клеток в колбу для клеточных культур T75.

2. Выделение первичных фибробластов из дермы

1. Разрежьте дермальную ткань на более мелкие кусочки (1 мм²) и перенесите их в коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте 10 мл раствора коллагеназы (5 ЕД/мл в PBS⁺) и инкубируйте в течение 45 мин на водяной бане при 37 °C. Центрифугируйте смесь кусочков ткани и клеток при 200 x g в течение 5 мин.
2. Дважды промойте клеточную гранулу 10 мл DMEM, содержащей 4,5 г/л глюкозы и L-глютамина, но без L-пирувата. Наконец, ресуспендируйте кусочки ткани в 2 мл DMEM, содержащего 1% (v/v) гентамицина и 10% FCS. Переложите их в колбу для клеточных культур T25 и инкубируйте в клеточном инкубаторе при температуре 37 °C и 5%_CO2 в течение ночи><. ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой объем позволяет фибробластам мигрировать из остатков ткани и заставляет их прикрепляться к колбе для культуры.
3. На следующее утро добавьте еще 6 мл DMEM/Gentamycin/FCS и инкубируйте в течение 2-3 дней при 37 °C, пока клетки не достигнут 80-90% конфлюенции.

3. Генерация кожного компартмента органотипических полнокожных реконструкций

1. Создание моделей кожи с использованием 24-луночных микропористых мембранных вставок (размер пор 8 мкм), помещенных в 24-луночные планшеты.
   заметка: Убедитесь, что вы используете не подвесные, а стоячие вставки, потому что они будут помещены в 6-луночную пластину для воздушно-жидкостного выращивания на более позднем этапе.
2. Готовят раствор для нейтрализации геля (ГНЛ), а также питательные среды, называемые ММ, и эндотелиальные питательные среды (ЭГМ). Чтобы предотвратить коагуляцию, храните коллаген I типа (обычно из крысиного хвоста, 3,5-4 мг/мл в 0,02 N уксусной кислоты) на льду до использования, потому что он начинает желить при RT.
3. Повторно суспендируйте 1 x 10⁵ фибробластов на вставку, в GNL и быстро смешайте клеточную суспензию с коллагеном в соотношении 1:3 в конечном объеме 500 мкл/вставка. Перемешивайте, аккуратно пипетируя вверх и вниз, чтобы избежать образования пузырьков, так как пузырьки могут ухудшить качество реконструкции кожи.
4. Дайте отдельным дермальным гелям осесть, выдержав их без среды при РТ в течение 30 минут в стерильном капюшоне. Затем покройте каждый гель DMEM, содержащим 4,5 г/л глюкозы, 1% L-глутамина, 10% FCS и без L-пирувата, и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.

4. Генерация эпидермального компартмента органотипических реконструкций всей кожи

1. На следующий день удалите среду из дермальных гелей и уравновесьте их средой EGM (10% FCS, 1% PenStrep, 10 мг/мл гентамицина) в течение 2 ч при 37 °C. Извлеките среду и осторожно засейте 1 x 10⁵ кератиноцитов, ресуспендированных в 100 μл EGM, поверх дермального геля.
2. Инкубировать реконструированные тела в течение 1,5 ч при 37 °C, чтобы кератиноциты могли прилипнуть к дермальному компартменту.
   заметка: Во время этого инкубационного периода гели начнут сжиматься из-за сокращения, вызванного фибробластами, и, таким образом, по крайней мере частично отделяются от стенок вставки.
3. Покройте эквиваленты кожи примерно 800 μл EGM и осторожно удалите остатки геля со стенки вставки с помощью небольшого (белого) наконечника для дозатора. Культивируют кожные эквиваленты, погруженные в EGM на 7 дней в клеточный инкубатор при 37 °C, 5%_CO2, и меняют среду через день><. заметка: За это время кожные эквиваленты значительно уменьшится.

5. Воздушно-жидкостное культивирование органотипических реконструкций всей кожи

1. На 8-й день перенесите каждую вставку в отдельную лунку 6-луночного планшета. Добавляйте в каждую лунку только 1,2-1,4 мл MM среды, чтобы реконструкция кожи снабжалась средой со дна лунки, но не была покрыта средой.
   заметка: Культивирование на границе воздух-жидкость позволяет стратифицировать эпидермальную часть и создать полный ороговевший слой (stratum corneum).
2. В течение следующих 10-17 дней меняйте носитель, как указано в разделе 5.1, через день. В этот период добавляйте в среду лекарства или другие раздражители по мере необходимости. Аккуратно удалите полную реконструкцию кожи с микропористой мембранной вставки с помощью изогнутого пинцета для дальнейшего анализа, например, иммуногистохимического анализа (Рисунок 1).

Результаты

Рисунок 1: Выращивание 3D органотипических реконструкций кожи в погружении в среду и на границе раздела воздух-жидкость. На 0-й день первичные кератиноциты засеиваются поверх дермального компартмента, состоящего из первичных фибробластов, встроенных в коллагеновый матрикс I типа. 3D-реконструкция кожи остается культивируемой под водой с помощью EGM в течение 7 дней, отделяется от стенки вставки и нач...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фетальный сывороточный альбумин (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270106	добавить 10 % в среду для культивирования клеток
Трипсин-ЭДТА	Thermo Fisher Scientific	25300054	1X разбавленный в PBS
DMEM	Thermo Fisher Scientific	41965062	для культивирования первичных фибробластов
Диспайз	Технологии Gibco life	17105041	2U/мл, растворить в PBS
Коллаген I типа	BD Biosciences	354249	Обычно из крысиного хвоста, концентрация должна составлять 3,5-4 мг/мл
24-луночные вставки Nunclon	Нунк	140629	Размер пор 8 мкм; используйте стоячие, а не висячие вставки
Сетчатый фильтр для ячеек	BD Falcon	No 352360 (Английский	жёлтый
Гентамицин	Thermo Fisher Scientific	15750060	растворение в PBS
Кератинцитарная среда Keralife	Клеточные системы		не добавляйте ССК или антибиотики
Коллагеназа	СЕРВА	17454	Стандартная марка NB4
ювенильные кератиноциты человека	Клеточные системы	ФК-0007	альтернатива собственному препарату из ювенильной крайней плоти
ювенильные фибробласты человека	Клеточные системы	ФК-0001	альтернатива собственному препарату из ювенильной крайней плоти
ЭФР	Технологии Gibco life	13247-051 (Английский)	добавляйте 10 нг/мл только для генерации среды EGM
Хлорид кальция	Мерк Кемикалс	2381	прибавьте 1,9 мМ для генерации EGM и 3,8 мМ для MM среды
Селеновая кислота	Альфа Аэсар	18851	прибавьте 53 нМ для генерации среды EGM и MM
инсулин	Лилли	HI0219 Hum Pen 3мл 100 Э.И./мл	добавить 5 мкг/мл для получения среды EGM и MM
Этаноламин	Сигма-Олдрич	Е-0135	добавьте 0,1 мМ для генерации среды EGM и MM
-этаноламин	Сигма-Олдрич	-0503	добавьте 0,1 мМ для генерации среды EGM и MM
Голотрансферрин	Сигма-Олдрич	Т-0665	добавить 5 мкг/мл для получения среды EGM и MM
Трийодтиронина	Сигма-Олдрич	Т-6397	добавляем 20 пМ для генерации среды EGM и MM
гидрокортизон	Сигма-Олдрич	Х-088816	добавить 0,4 мкг/мл для получения среды EGM и MM
Прогестерона	Сигма-Олдрич	-8783	добавить 10 нМ только для генерации среды EGM
Хепес	Сигма-Олдрич	Н-3784	добавляем 15 мМ для генерации среды EGM и MM
серин	Сигма-Олдрич	С-4311	добавляем 1 мМ для генерации среды EGM и MM
Холина хлорид	Сигма-Олдрич	С-7017	добавьте 0,64 мМ для генерации среды EGM и MM
dFCS	Сигма-Олдрич	F-0392 Лот 086K0361	добавить 2 % за генерацию среды EGM и MM
Аденин	Сигма-Олдрич	А-9795	добавляем 0,18 мМ для генерации среды EGM и MM
L-глютамин	PromoCell	С-42209	добавить 7,25 мМ для генерации среды EGM и MM
Хлорид стронция	Сигма-Олдрич	255521	добавляем 1 мМ для генерации среды EGM и MM

) г. г.