$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Получение клеток B16-BL6
- Извлеките планшеты для клеточных культур из инкубатора с температурой 37 градусов и поместите их в стерильный колпак. Пластинки должны примерно на 70% совпадать с клетками мышиной меланомы B16-BL6. Большее слияние может изменить метастатический потенциал клеток.
- Добавьте 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА на тарелку, оставьте на 1 минуту, а затем аспирируйте раствор трипсина-медиа.
- Добавьте 1 мл трипсина на тарелку и верните тарелки в инкубатор на 10 мин.
- Переместив планшеты из инкубатора в стерильный колпак, добавьте в каждую тарелку по 4 мл бессывороточной среды Rosewell Park Memorial Institute (RPMI).
- Соберите клетки с помощью стерильной моторизованной пипетки. Выбросьте клетки в нижнюю часть пластины, прижав кончик под очень небольшим углом, чтобы разрушить клетки. Повторите несколько раз, чтобы обеспечить адекватное разделение клеточных комков, которые в противном случае могут закупорить иглу выброса. Соберите и перенесите в коническую пробирку объемом 50 мл.
- Используйте гемоцитометр для определения плотности клеток. Сохраняя общее количество клеток B16-BL6 постоянным, определите объем RPMI без сыворотки, необходимый для достижения конечных концентраций 0, 0,065, 0,015, 0,25 и 0,5 млн клеток/мл.
- Равномерно распределите среды в пробирке объемом 50 мл и конической пробирке объемом 15 мл. Центрифугируйте конические пробирки при давлении 2 250 x g в течение 5 минут. Сцеживайте СМИ. Добавьте соответствующий объем RPMI без сыворотки и подтвердите желаемую плотность клеток с помощью гемоцитометра. Отрегулируйте плотность, добавив дополнительные обороты или соответственно вращаясь и ресуспендируя в меньшем объеме.
- Аликвоту 500 мкл каждой клеточной суспензии в меченые пробирки по 1,8 мл на льду.
2. Инъекция в хвостовую вену
- Приобретайте самок C57BL/6 мышей (возраст 6-8 недель), по 5 мышей в группе. Подождите несколько дней, чтобы мыши привыкли.
- Возьмите мышь, которую держите за хвост, и направьте ее назад вперед в удерживатель мыши. Когда туловище находится в основной камере ограничителя, а хвост снаружи него, потяните мышь к концу ограничителя. Вставьте ограничитель-поршень, продолжая нажимать до тех пор, пока мышь не будет надежно закреплена.
- Поверните мышь на 90 градусов так, чтобы одна из боковых хвостовых вен была обращена вверх. Используя спиртовую салфетку, энергично очистите боковую сторону хвоста мыши, особенно там, где хвостовая вена наиболее заметна><.
заметка: Хорошее освещение необходимо для эффективной визуализации хвостовых вен на мышах B57BL/6J. Нагревательные лампы или хирургические прокладки с подогревом, хотя и не являются необходимыми, также помогут увеличить объем хвостовой вены.
- В стерильном культуральном колпаке соберите 300 мкл клеточных культуральных сред из пробирки с производительностью 2 миллиона клеток/мл. Переверните иглу, щелкая стороной и нажимая на поршень, чтобы вытолкнуть пузырьки из шприца. Выталкиваем культуру-RPMI, чтобы конечный объем составил 250 μл.
- Вытяните хвост мыши недоминирующей рукой. Держите хвост так, чтобы проксимальный конец хвоста был поднят указательным пальцем недоминирующей руки, а дистальная часть хвоста была прижата большим пальцем><.
заметка: Таким образом, хвостовая вена удерживается в боковом положении, параллельно ограничительной поверхности, с возможным конгруэнтным входом в более дистальную часть хвоста.
- Введите иглу в хвостовую вену, ближе к дистальному концу, сначала под небольшим углом вниз, а затем отрегулируйте иглу так, чтобы она совпадала с углом хвостовой вены при дальнейшем введении (опуская конец поршня шприца относительно иглы).
- Введите иглу примерно на 1 см в хвостовую вену. После введения начните нажимать на поршень, удерживая иглу неподвижно.
заметка: Если игла находится в хвостовой вене и конец иглы не закупорен, среда должна беспрепятственно поступать в вену. Эффективная инъекция характеризуется выводом крови из вены. Если есть резистентность, или в месте инъекции начинает образовываться пузырь, удалите иглу и повторите попытку в более проксимальном месте вдоль хвостовой вены.
- Извлеките иглу из вены и выбросьте ее. Приложите марлю к месту входа, чтобы остановить кровотечение.
- Извлеките поршень из ограничителя и поместите мышь в клетку для реципиента.
- Повторите для всех остальных концентраций.
заметка: Становление легочных очагов занимает примерно 2-3 недели, с вариабельностью в зависимости от клеточной линии и желаемого размера очагов. Тем временем мышей следует контролировать на предмет симптомов, которые могут оправдать раннюю эвтаназию, таких как чрезмерное дыхание.
3. Подсчет очагов в легких
- Усыпите мышь, поместив ее в камеру сCO2 и подвергнув ей воздействию 100%CO2, вводимого со скоростью 10-30% от объема камеры в минуту, в течение 5 минут. Затем вывих шейки матки.
- Растопыриваем мышку на пенопласте. С помощью хирургических ножниц создайте хирургический разрез вдоль грудины.
- Сделайте два дополнительных разреза, как от верхней части разреза грудины, так и разветвляющиеся к плечам мыши, обнажая грудную клетку.
- Сделайте два надреза, каждый по боковым сторонам грудины, чтобы удалить грудную клетку от туловища, обнажив легкие и сердце.
- Придерживая сердце хирургическим пинцетом, перережьте пищевод и дыхательное горло, освободив сердце и легкие от мыши. Поместите под препарирующий микроскоп с 10-кратным увеличением для лучшей визуализации.
- Отделите сердце от легких и удалите тимус, оставив только два легких.
- Когда легкие находятся под рассекающим эндоскопом, начинают подсчитывать легочные очаги. Каждый очаг должен выглядеть в виде круглого коричневого выступа на поверхности легких.
- Для согласованности между мышами подсчитайте количество фокусов на поверхности доли, а затем инвертируйте эту долю. Выполнение каждого из четырех лепестков по отдельности облегчает подсчет.
- Сохраните и исправьте легкие при выполнении ИГХ, в противном случае выбросьте остатки.