HCR-ДНК FISH: Метод флуоресцентной гибридизации in situ для обнаружения вирусной ДНК в инфицированных клетках

Аннотация

Источник: Wei Liu et al., Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео клетки, инфицированные вирионами MCPyV, были подвергнуты цепной реакции гибридизации in situ для обнаружения специфичных для MCPyV геномов. Кроме того, метод DNA-HCR был объединен с FISH для визуализации ДНК MCPyV в инфицированных клетках кожи человека.

Протокол

1. Заражение

1. Поддерживайте первичные дермальные фибробласты человека в DMEM с помощью 10% сыворотки плода телят, 1% заменимых аминокислот и 1% L-глутамина. Достигнув слияния, расщепляют фибробласты в соотношении 1:4 без вращения вниз.
   заметка: Для достижения максимальной эффективности инфицирования MCPyV используйте первичные фибробласты между проходами 5 и 12, которые активно делятся в момент осаждения.
2. Чтобы инфицировать дермальные фибробласты человека, необходимо аспирировать среду и промыть клетки с помощью DPBS.
3. Добавьте в чашку 1 мл 0,05% Trypsin-EDTA и выдерживайте при 37 °C в течение 5-10 минут.
4. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки отслаиваются от чашки.
5. Добавьте в чашку 10 мл среды DMEM/F12, содержащей 20 нг/мл EGF, 20 нг/мл bFGF и 3 мкМ CHIR99021, которые стимулируют инфекцию MCPyV, и перенесите клеточный раствор в пробирку объемом 15 мл.
6. Уменьшите количество клеток при 180 x g в течение 2 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в среде DMEM/F12, содержащей 20 нг/мл EGF, 20 нг/мл bFGF и 3μM CHIR99021 в соотношении 2-4 x 10⁴ клеток/мл.
7. Затравите 200 мкл клеточной суспензии с добавлением 1 мг/мл коллагеназы IV типа в каждую лунку 96-луночного планшета. Размораживание вирионного запаса MCPyV на льду. Добавьте 10,⁹ эквивалентов вирусного генома вирионов MCPyV на 1 мкл йодиксанола на каждые 2 500–5 000 инфицированных клеток. Осторожно постучите по боковой стороне планшета и поместите планшет в инкубатор.
8. После инкубации при 37 °C в 5%_CO2 в течение 48-72 ч добавьте по 20% FBS в каждую лунку.
9. Дайте инфекции протекать при 37 °C при 5%_CO2 в течение 72-96 часов.

2. In situ DNA-HCR

1. Зафиксируйте клетки, культивируемые на покровных листах, с 4% PFA в PBS в течение 10 мин. Дважды промойте покровные стекла PBS, затем обработайте их 70% этанолом для проникновения в клетки при 4 °C в течение ночи><. заметка: Фиксированные образцы могут оставаться в таком состоянии в течение нескольких дней.
2. Предварительную гибридизацию образцов путем замены этанола зондовым буфером для гибридизации и инкубации в течение 60 мин при РТ.
3. Разведите зонд (зонды) (1 мкМ) (Таблица 1) в буферном растворе зонда для гибридизации при разведении 1:500 за 30 мин до окончания стадии предварительной гибридизации и инкубируйте при 45 °С.
4. В конце инкубации пипетку ~10 мкл разведенной смеси зондов на покровное стекло на предметные стекла микроскопа. Поместите покровные стекла клеточной стороной вниз на соответствующие капли смеси зондов для гибридизации. Заклейте края и заднюю часть покровных стекол к предметным стеклам обильным количеством резинового цемента.
5. Нагрейте предметные стекла с добавленными щупами при температуре 94 °C в течение 3 минут, установив предметные стекла на плоскую сторону нагревательного блока. Перенесите предметные стекла во увлажненную камеру и инкубируйте при температуре 45 °C в течение ночи. Чтобы сделать простую увлажненную камеру, слегка смочите стерильные бумажные полотенца dH₂O и поместите их на дно пластиковой емкости, которая уплотняется резиновой прокладкой.
   заметка: Во время нагрева резиновый цемент может кратковременно пузыриться. Однако следите за тем, чтобы пломба не сломалась.
6. Осторожно снимите резиновый цемент с помощью щипцов и поместите покровные стекла ячейкой вверх обратно в лунки 24-луночного планшета. Промойте покровные стекла с помощью буфера для промывки щупом при температуре RT три раза.
7. Инкубировать покровное стекло в амплификационном буфере (200 мкл в 24-луночных планшетах) при RT в течение 30-60 мин.
8. Между тем, отжигают каждую из двух меченых олигонуклеотидных шпилек, узнавая зонды (табл. 1) в отдельных ПЦР-пробирках, нагревая до 94 °C в течение 90 с и охлаждая до RT в течение 30 мин при защите от света. Смешайте две шпильки в буфере для усиления, каждая в разведении 1:50.
9. Сделайте поверхность для реакции амплификации, натянув парафиновую пленку на открытую поверхность крышки 24-луночной пластины. Пипеткой нанесите 50-100 мкл капли смеси шпильки/амплификаторного буфера на парафиновую пленку для каждого покровного стекла. С помощью щипцов осторожно удалите покровные стекла из раствора для предварительного усиления. Высушите покровное стекло, прикоснувшись к краю пористой одноразовой салфеткой, и положите клеточной стороной вниз на каплю усиления.
10. Поместите крышку тарелки с покровными стеклами во увлажненную камеру и инкубируйте в течение ночи в RT в темноте.
11. Верните покровные стекла в лунки еще раз. Инкубируйте образцы с 5x SSCT [5x натрия хлорида цитрата натрия (SSC) 0,1% Tween 20, отфильтрованным через фильтр 0,22 мкм], содержащим 0,5 мкг/мл DAPI, в течение 1 ч в режиме RT. Дважды промойте образцы 5x SSCT в режиме RT. Дважды промойте образцы 5x SSCT в режиме RT.
12. Закрепите покровные стекла на предметных стеклах микроскопа. Проанализируйте клетки и визуализируйте образцы с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.

Щуп MCPyV 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgccctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCTCCAACTCAC
Щуп MCPyV 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccaagccccctgccaacttgaaa ATTTT CACATTTACAGACCTACCTACCTCCAACTCTCAC
Щуп MCPyV 3	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCTCCAACTCTCAC
Щуп MCPyV 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttttgctaattaagcctcttaagtcagagtcctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCCAACTCTCAC
Щуп MCPyV 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATCGCTTC TAAAA aagcttctcctcctgtaagaatagtccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Щуп MCPyV 6	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcagagcc ATTTT CACATTTACTACCCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Щуп MCPyV 7	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagttgattcatcgcagaagagatccccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Щуп MCPyV 8	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Щуп MCPyV 9	CCTCAACCTACCTCCAACTCACCATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccaaattttcgcttttttgagaatggagggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Щуп MCPyV 10	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtctgcggctgttggtggcaaatggttgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Зонд для ВПЧ 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttgggtcgctctgggtggttctctggt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCTCCAACTCTCAC
Зонд для ВПЧ 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCACCATATCGCTTC TAAAA acaatattattaatgtaatgggctctgtccggttgctgctgctgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Зонд для ВПЧ 3	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtaagtccaaatgcaaatgcaataccaatcgcaaccaac ATTTT CACATTTACAGACCTACCTCCAACTCTCAC
Зонд для ВПЧ 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggggggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Зонд для ВПЧ 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctctccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCTCCAACTCTCAC

Таблица 1: Зонды, использованные в исследовании.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
буфер гибридизации зонда	Молекулярные технологии
буфер для промывки зонда	Молекулярные технологии
Буфер усиления	Молекулярные технологии
Шпильки с меткой Alexa 594	Молекулярные технологии	B4	Защита от света
Параформальдегид	Sigma	P6148