Выделение кератиноцитов кожи человека: метод культивирования первичных кератиноцитов из образцов кожи

Аннотация

Johansen, C. et al. Генерация и культивирование первичных кератиноцитов человека из кожи взрослого человека. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео описывается выделение кератиноцитов — наиболее заметных клеток эпидермального слоя кожи человека, с помощью комбинации методов ферментативного переваривания и механического разрушения. Этот метод помогает в преимущественном росте кератиноцитов по сравнению с другими типами клеток кожи с использованием селективной питательной среды.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Выделение кератиноцитов из кожи человека

1. Начните с приготовления следующих растворов: 50 мл раствора 0,25% трипсина и 0,1% глюкозы в DPBS. Перемешайте и профильтруйте стерилизованный (0,2 мкм) раствор. Приготовьте 10 мл RPMI-1640 + 2% раствор FBS, 50 мл DPBS и кератиноцитарную сывороточную среду (KSFM). Добавьте добавки КСФМ и 250 мкл гентамицина к 500 мл КСФМ. Перед применением растворы предварительно подогреть до 37 °C.
2. Соберите кожу у здоровых взрослых добровольцев, перенесших пластическую операцию. Используемые образцы кожи имеют размеры примерно 10 см x 15 см, но могут различаться по размеру. Сохраняйте кожу прохладной во время транспортировки, транспортируя образцы кожи в коробке из пенополистирола, содержащей охлаждающий элемент. При необходимости образец кожи можно хранить при температуре 4 °C в течение ночи.
3. Удалите жир из-под участка кожи с помощью стерилизованных ножниц, скальпелей и щипцов.
4. С помощью игл застегните участок кожи (примерно 10 см х 15 см) на стерильном чехле поверх тарелки. Сначала очистите кожу сухим стерилизованным марлевым салфеткой. Затем очистите кожу с помощью стерилизованной марлевой салфетки с 70% этанолом.
5. С помощью рубанка для ног срежьте верхний слой (эпидермис) участка кожи и положите его в чашку Петри шириной 9 см. Затем немедленно добавьте в чашку Петри 25 мл раствора DPBS/трипсина/глюкозы (приготовленного на шаге 1.1). Выдерживать в течение 30 минут при температуре 37 °C.
6. С помощью пипетки удалите раствор DPBS/трипсина/глюкозы из чашки Петри и добавьте 10 мл RPMI-1640 + 2% FBS для инактивации трипсина.
7. С помощью двух щипцов освободите клетки эпидермиса в среду, осторожно соскабливая и взбалтывая как эпидермальный, так и дермальный компартмент участков кожи.
8. Отфильтруйте суспензию эпидермальных клеток через металлический фильтр (размер отверстия 1 мм) и соберите в пробирку объемом 50 мл. Добавьте оставшиеся срезы кожи в пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл RPMI-1640 без FBS и вихря на 10 с. Отфильтруйте суспензию через металлический фильтр в пробирку объемом 50 мл, содержащую суспензию эпидермальных клеток. Добавьте DPBS в общий объем 50 мл.
9. Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 10 мин при 450 x g при комнатной температуре.
10. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу эпидермальных клеток примерно в 10 мл при температуре 37 °C KSFM в зависимости от размера клеточной гранулы. Подсчитайте клетки с помощью метода окрашивания Трипановый синий под микроскопом. Количество клеток, полученных из участка кожи размером 10 см х 15 см, составляет примерно 50-100 х 10⁶ клеток. В каждую 75 см² культуральную колбу перенесите 8 х 10⁶ клеток вместе с 12 мл 37 °С КСФМ. Осторожно встряхивайте колбы с культурой, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
11. Инкубируйте кератиноциты в инкубаторе при температуре 37 °C при 100% влажности и 5%_CO2. Меняйте средство через 2 дня и три раза еженедельно. Пассаж клеток при конфлюентности культуры на 70-80%, что занимает примерно 2 недели в зависимости от скорости пролиферации кератиноцитов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
КСФМ	ThermoFisher Scientific	17005-034	Среда для культивирования клеток
Пищевые добавки КСФМ	ThermoFisher Scientific	37000-015	Пищевые добавки для КСФМ
ДПБС	ThermoFisher Scientific	14190-144	DPBS без кальция и Магний
Дмсо	Сигма-Олдрич	Д8418	Диметилсульфоксид
Гентамицин	ThermoFisher Scientific	15710-049	Аддитивная среда для клеточных культур
Стерилизационный фильтр	Сарториус	16534	Шприцевой фильтр с размером пор 0,2<бр/> мкм
трипсин	Сигма-Олдрич	Т7409	Используется для трипсинизации клеток
глюкоза	Сигма-Олдрич	Г7528	- T
РПМИ-1640	ThermoFisher Scientific	No 61870-010	- T
ФБС	ThermoFisher Scientific	16000044	Используется для инактивации трипсина
щипцы	- T	- T	Щипцы любой фирмы могут быть использованный
ножницы	- T	- T	Ножницы от любой фирмы можно <бр/> использованный
скальпель	Суонн Мортон	0501	Скальпели от любой компании могут быть использованный
70% этанол	- T	- T	- T
Марлевые салфетки	НОБАМЕД	875420 (Английский	Марлевые салфетки от любого поставщика могут <бр/> будет использоваться
Фугальтерный станок	Кредо Золинген	1510	Фугальтер от любого поставщика can будет использоваться
Чашки Петри	ТЭС	93100	Чашки Петри от любого поставщика can будет использоваться
Металлический фильтр	- T	- T	Собственное отверстие диаметром 1 мм металл фильтр
75 см2 колбы для культур	NUNC	156499	- T
150 см2 колбы для культур	Ттп	90151	- T
0,05% раствор трипсин-ЭДТА	ThermoFisher Scientific	25300-062	Используется для трипсинизации клеток при Пассирование

гг. г. ) г.