Выделение кератиноцитов кожи человека: метод культивирования первичных кератиноцитов из образцов кожи

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Выделение кератиноцитов из кожи человека

1. Начните с приготовления следующих растворов: 50 мл раствора 0,25% трипсина и 0,1% глюкозы в DPBS. Перемешайте и профильтруйте стерилизованный (0,2 мкм) раствор. Приготовьте 10 мл RPMI-1640 + 2% раствор FBS, 50 мл DPBS и кератиноцитарную сывороточную среду (KSFM). Добавьте добавки КСФМ и 250 мкл гентамицина к 500 мл КСФМ. Перед применением растворы предварительно подогреть до 37 °C.
2. Соберите кожу у здоровых взрослых добровольцев, перенесших пластическую операцию. Используемые образцы кожи имеют размеры примерно 10 см x 15 см, но могут различаться по размеру. Сохраняйте кожу прохладной во время транспортировки, транспортируя образцы кожи в коробке из пенополистирола, содержащей охлаждающий элемент. При необходимости образец кожи можно хранить при температуре 4 °C в течение ночи.
3. Удалите жир из-под участка кожи с помощью стерилизованных ножниц, скальпелей и щипцов.
4. С помощью игл застегните участок кожи (примерно 10 см х 15 см) на стерильном чехле поверх тарелки. Сначала очистите кожу сухим стерилизованным марлевым салфеткой. Затем очистите кожу с помощью стерилизованной марлевой салфетки с 70% этанолом.
5. С помощью рубанка для ног срежьте верхний слой (эпидермис) участка кожи и положите его в чашку Петри шириной 9 см. Затем немедленно добавьте в чашку Петри 25 мл раствора DPBS/трипсина/глюкозы (приготовленного на шаге 1.1). Выдерживать в течение 30 минут при температуре 37 °C.
6. С помощью пипетки удалите раствор DPBS/трипсина/глюкозы из чашки Петри и добавьте 10 мл RPMI-1640 + 2% FBS для инактивации трипсина.
7. С помощью двух щипцов освободите клетки эпидермиса в среду, осторожно соскабливая и взбалтывая как эпидермальный, так и дермальный компартмент участков кожи.
8. Отфильтруйте суспензию эпидермальных клеток через металлический фильтр (размер отверстия 1 мм) и соберите в пробирку объемом 50 мл. Добавьте оставшиеся срезы кожи в пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл RPMI-1640 без FBS и вихря на 10 с. Отфильтруйте суспензию через металлический фильтр в пробирку объемом 50 мл, содержащую суспензию эпидермальных клеток. Добавьте DPBS в общий объем 50 мл.
9. Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 10 мин при 450 x g при комнатной температуре.
10. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу эпидермальных клеток примерно в 10 мл при температуре 37 °C KSFM в зависимости от размера клеточной гранулы. Подсчитайте клетки с помощью метода окрашивания Трипановый синий под микроскопом. Количество клеток, полученных из участка кожи размером 10 см х 15 см, составляет примерно 50-100 х 10⁶ клеток. В каждую 75 см² культуральную колбу перенесите 8 х 10⁶ клеток вместе с 12 мл 37 °С КСФМ. Осторожно встряхивайте колбы с культурой, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
11. Инкубируйте кератиноциты в инкубаторе при температуре 37 °C при 100% влажности и 5%_CO2. Меняйте средство через 2 дня и три раза еженедельно. Пассаж клеток при конфлюентности культуры на 70-80%, что занимает примерно 2 недели в зависимости от скорости пролиферации кератиноцитов.