Выделение стволовых клеток меланомы: метод получения CD133-положительных и отрицательных клеток меланомы с помощью магнитно-активируемой сортировки клеток

Аннотация

Источник: Welte, Y. et al. Культура клеток, полученных от пациента, и выделение CD133+ предполагаемых раковых стволовых клеток из меланомы. J. Vis. Exp. (2013)

В этом видео описывается техника выделения CD133 отрицательных и положительных стволовых клеток меланомы из первичной клеточной линии меланомы с использованием магнитно-активируемой сортировки клеток. CD133-положительные ЦСК меланомы дополнительно изучаются для понимания механизмов онкогенеза меланомы.

Протокол

1. Магнитная сортировка клеток меланомы CD133⁺ и CD133^- с помощью столбцов LS

1. Подготовьте буфер MACS, содержащий 2 мМ ЭДТА и 5% FCS в PBS. Перемешайте путем инвертирования и стерилизации фильтрата с помощью фильтрующего блока Steritop-GP 0,22 мкм. Охладите буфер до 4-8 °C и дегазируйте перед использованием.
2. Предварительно нагрейте среду Accutase, PBS и Quantum 263 до 37 °C.
3. Промойте 80% сливающихся клеток PBS. Добавьте соответствующее количество Аккутазы и инкубируйте до тех пор, пока клетки не отделятся от поверхности культуры. Соберите клетки в пробирку объемом 50 мл с помощью среды Quantum 263.
4. Определите количество ячеек и центрифугируйте необходимое количество ячеек в течение 5 мин при 300 x g и 4-8 °C. (Согласно протоколу Милтеньи, на одну колонку LS можно загрузить максимум 2 x 10⁹ ячеек. Необходимо определить оптимальные числа, специфичные для клеточной линии, которые могут быть значительно ниже.) Аспират надосадочная жидкость полностью.
5. Ресуспендируйте максимум 1x 10⁸ клеток с буфером MACS объемом 350 мкл (для большего количества клеток увеличьте все последующие объемы буфера MACS, блокирующего реагента FcR, CD133/1-биотина и антибиотиновых микрогранул соответственно).
6. Добавьте 100 мкл блокирующего реагента FcR.
7. Добавьте 50 мкл CD133/1-биотина. Хорошо перемешайте с помощью вихря и выдерживайте при температуре 4-8 °C в течение 10 минут.
8. Промойте ячейки, добавив 10 мл буфера MACS, и центрифугируйте в течение 5 минут при 300 x g и 4-8 °C. Полностью аспирируйте надосадочную жидкость.
9. Повторите шаг стирки (1.8).
10. Ресуспендируйте клеточную гранулу с буфером MACS объемом 400 мкл.
11. Добавьте 100 мкл антибиотиновых микрогранул. Хорошо перемешайте с помощью вихря и выдерживайте при температуре 4-8 °C в течение 15 минут.
12. Тем временем подготовьте сепаратор MACS к магнитной сепарации. Прикрепите QuadroMACS к многостендовому сепаратору MACS. Вставьте необходимое количество столбцов LS с крыльями столбца вперед в магнитное поле QuadroMACS. Поместите фильтр предварительной сепарации (с нейлоновой сеткой 30 мкм) в каждую колонку LS и соответствующую сборную пробирку (15 мл или 50 мл) под каждую колонку. Подготовьте фильтр и колонку путем промывки буфером MACS объемом 3 мл. Отбросьте проточные.
13. Промойте ячейки, добавив 10 мл буфера MACS, и центрифугируйте в течение 5 минут при 300 x g и 4-8 °C. Полностью аспирируйте надосадочную жидкость.
14. Ресуспендируйте клетки буфером MACS объемом 500 мкл и нанесите суспензию клеток на колонку LS с помощью фильтра предварительной сепарации.
15. Промойте три раза буфером MACS объемом 3 мл на колонку. Добавляйте свежий буфер только в том случае, если резервуар столбца пуст.
16. Весь собранный сток содержит немеченую CD133-клеточную фракцию.
17. Выбросьте фильтр предварительной сепарации, снимите колонку с сепаратора и поместите ее на подходящую сборную трубку.
18. Нанесите 5 мл буфера MACS. Немедленно промойте меченые клетки CD133⁺, сильно вдавливая поршень в колонку.
19. Чтобы повысить чистоту отрицательной фракции, нанесите суспензию ячеек на новую уравновешенную колонку LS, вставленную в QuadroMACS. Сток содержит фракцию CD133^-.
20. Откажитесь от столбцов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аккутаза	Компания PAA Laboratories GmbH	Л11-007
Дегидрат динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)	Сигма-Олдрич, Инк.	Е-7889
КД133/1 (W6B3C1)	Милтеньи Биотек ГмбХ	Тел.: 130-092-395
Непрямой набор микрогранул CD133 для человека	Милтеньи Биотек ГмбХ	Тел.: 130-091-895	В составе: CD133/1(AC133)-биотин, антибиотиновые микрогранулы и реагент, блокирующий FcR
Квант 263	Компания PAA Laboratories GmbH	У15-815
Многостендовый сепаратор MACS	Милтеньи Биотек ГмбХ	Тел.: 130-042-303
Разделительные колонны MACS 25 LS Колонны	Милтеньи Биотек ГмбХ	Тел.: 130-042-401
Сепаратор QuadroMACS	Милтеньи Биотек ГмбХ	Тел.: 130-090-976