Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подопытные животные, реактивы и оборудование
- Используйте мышей соответствующего возраста и пола. Начните исследование в возрасте 7-9 недель, потому что кожа у большинства мышей находится в телогене (фаза покоя) примерно в этом возрасте.
- Наблюдайте за поведением животных во время исследования и если они дерутся, что часто случается с самцами, размещайте их отдельно. Драки могут привести к порезам на коже, которые способствуют образованию опухолей. Самок мышей предпочитают из-за их менее агрессивного поведения. Типичный размер экспериментальной группы колеблется от 8 до 20 животных в группе.
заметка: Расчеты мощности, основанные на биологической дисперсии, наблюдаемой в более ранних исследованиях, помогают выбрать достаточно большой размер группы. В качестве примеров в этой статье используются штаммы Balb/c и C57BL/6. Тем не менее, многие другие линии мышей, такие как SENCAR и FVB, использовались с моделью DMBA-TPA и крысами Wistar и Sprague-Dawley. Лицензия от национального или местного комитета по работе с животными необходима до начала исследования. В дополнение к соображениям общего благополучия, модельно-специфичными конечными точками обычно являются плоскоклеточная карцинома (ПКК) и инфекция кожи. Царапины на коже из-за зуда после применения опухолевых химических веществ в ацетоне являются типичными, но в остальном животные не должны проявлять никаких признаков дискомфорта. Регулярное взвешивание (например, 2 раза в месяц) помогает оценить благополучие животных.
- Используйте ДМБА и ТФК, разведенные в ацетоне. Рабочая концентрация ДМБА составляет 250 г/л. Доза для одного животного составляет 50 мкг ДМБА на 200 мкл ацетона. Исходная концентрация ТФК составляет 125 г/л, а обработанная концентрация 25 г/л. Доза ТФА для одного животного составляет 5 мкг на 200 мкл ацетона.<бр/>
ВНИМАНИЕ: ДМБА вреден при проглатывании и может вызвать рак. Ацетон быстро испаряется и легко воспламеняется. Это может вызвать головокружение и раздражать глаза. Используйте дыхательную маску и/или работайте под вакуумным потоком. Меняйте перчатки после контакта с любым из этих химических веществ. Индивидуально вентилируемые клетки предотвращают распространение химических веществ во время содержания мышей. После нанесения соберите наконечники для пипеток, используемые для работы с ДМБА, и утилизируйте их как опасные отходы.
заметка: DMBA должен быть защищен от света. Разбавленный ТФК хранят при температуре -20 °С, желательно в защищенном от света месте.
- Приобретите следующее оборудование: весы, обычную бритву для меха, пипетки и наконечники соответствующего размера, обычную линейку, цифровой фотоаппарат, блокнот и ручку или компьютер для записи папиллом, систему ингаляционной анестезии или удерживатель мыши с отверстием на задней поверхности, а также систему углекислого наркоза для жертвоприношения мышей.
2. Индукция и продвижение папилломы кожи
- Сбрейте кожу с тыльной стороны и взвесьте животное. Позже брейте кожу по мере необходимости, но не во время химического воздействия.
заметка: Будьте осторожны при бритье вокруг папиллом и избегайте порезов на коже. Взвешивайте каждое животное каждые 2 недели, чтобы заметить любую потенциальную потерю веса.
- Нанесите 50 г ДМБА в 200 мкл ацетона местно на выбритую область с помощью пипетки через 48 часов после бритья шерсти. При необходимости удерживайте животное с помощью легкой ингаляционной анестезии или мышиного удерживателя.
- Через 7 дней дайте первую дозу TPA. Вносите 5 г ТФК в 200 мкл ацетона местно с помощью пипетки 2 раза в неделю, предпочтительно в понедельник и четверг или во вторник и пятницу.
- Подсчитывайте, записывайте и фотографируйте папилломы каждую неделю. Пальпируемое образование более 1 мм в диаметре считается папилломой, если оно сохраняется дольше 1 недели. Отметьте каждую отдельную папиллому на карте и каждую неделю перечисляйте ее размер — храните цифровые фотографии.
