Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Выделение меланоцитов и фибробластов
- Усыпьте от 0 до 4 дней детенышей мужского и/или женского пола C57Bl/6J путем обезглавливания, а также удалите конечности у усыпленных мышей с помощью хирургических ножниц.
- В ламинарном проточном шкафу кратковременно скатайте туловище каждой мыши в стерильной чашке Петри, содержащей 70% этанола. Извлеките ствол из этанола и поместите его в пустую стерильную чашку Петри.
- С помощью хирургических ножниц, стерилизованных в 70% этаноле, сделайте надрез на коже с вентральной стороны туловища, начиная от шеи и до хвоста. Снимите кожу с туловища мыши с помощью стерильных щипцов.
- Поместите кожу дермой вниз в 6-луночную чашку, содержащую 3 мл 1x раствора антибиотика/антимикотика и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2-3 минут.
- Включите измельчитель тканей со следующими настройками: Толщина среза: 1 мкм; Усилие лезвия: ~60% от максимального; Скорость: ~50% от максимальной.
- Перенесите кожу дермой вниз на диск измельчителя стерильных тканей и полностью пропустите кожу через измельчитель активированных тканей 3 раза.
- Перенесите гомогенизированную кожу в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 3 мл буфера для переваривания кожи (приготовьте 3 мл буфера для переваривания свежей кожи, содержащего 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1% раствор пенициллина/стрептомицина, 1% L-глутамина, 10 мг/мл коллагеназы типа I, 0,25% трипсина свиньи и 0,02 мг/мл дезоксирибонуклеазы I в RPMI 1640). Полученную суспензию перемешайте пипеткой вверх и вниз 10-15 раз с помощью микропипетки Р1000.
- Закройте коническую пробирку крышкой и инкубируйте образец на водяной бане при температуре 37 °C в течение 15 минут, переворачивая пробирку каждые 3-5 минут.
- Гранулируйте клетки в гомогенате кожицы путем центрифугирования конической трубки в качающемся роторе ведра при давлении 750 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
- С помощью микропипетки P1000 медленно и полностью удалите буфер для переваривания кожи, стараясь не повредить гранулу.
заметка: На этом этапе можно сохранить часть целой кожи и использовать ее в качестве контроля для подтверждения чистоты клеток. Процедите эти клетки через сетчатое фильтр 70 μм и продолжайте обработку.
- Тщательно ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл меланоцитарной среды путем пипетирования вверх и вниз 15-20 раз с помощью микропипетки P1000. Добавьте полученный клеточный раствор по каплям в непокрытую лунку 6-луночной чашки, содержащей 1 мл меланоцитарной среды.
- Поместите гальванизированный гомогенат кожи в инкубатор для тканевых культур, установленный при температуре 37 °C и 5%CO2. Дайте культурам инкубироваться в течение 40 мин.<бр/>
заметка: В течение этого времени некоторые фибробласты в гомогенате кожи прилипнут к непокрытой чашке, в то время как меланоциты и кератиноциты останутся во взвешенном состоянии.
- Перенесите надосадочную жидкость для культуры из чашки без покрытия в одну лунку предварительно вымытой 6-луночной чашки, покрытой коллагеном. Добавьте G418 в среду так, чтобы конечная концентрация составила 100 нг/мл.
- Добавьте 2 мл фильтрующего материала для фибробластов в одну лунку чашки без покрытия, теперь содержащую адгезивные фибробласты.
- Инкубируйте обе культуры в течение ночи в инкубаторе для тканевых культур, установленном при 37 °C и 5%CO2.
- Отдельно отсасывайте среду и любой мусор из каждой культуры, через 16-24 ч после покрытия. Вымойте каждую посуду дважды с 1 мл стерильного PBS, а затем добавьте 2 мл свежей меланоцитарной среды плюс 100 нг/мл G418 в культуру меланоцитов и 2 мл свежей фибробластной среды в культуру фибробластов. (Приготовьте 6 мл свежей меланоцитарной среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 7% лошадиной сыворотки, 1% раствор пенициллина/стрептомицина, 1% L-глутамина, 0,5 мМ дибутирилциклического АМФ (dbcAMP), 20 нМ тетрадеканоилфорбола 13-ацетата (ТПА) и 200 пМ холерного токсина (КТ) в питательной смеси F-12 Ham's Media.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрированные исходные растворы dbcAMP, TPA и CT могут быть изготовлены, аликвотированы и храниться в течение >1 года при температуре -80 °C. Базовые среды, в которых отсутствуют эти компоненты, могут храниться до 1 месяца при температуре 4 °C.
Приготовьте 4 мл фибробластной среды, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1% пенициллина/стрептомицина и 1% L-глутамина в модифицированной среде Dulbecco's Eagle Medium. Этот носитель может храниться при температуре 4 °C до 1 месяца)
- После обработки меланоцитарных культур G418 в течение 48 ч промойте клетки дважды 1 мл стерильного PBS и добавьте 2 мл свежей меланоцитарной среды без G418 в культуру.
заметка: Поскольку фибробласты в культуре меланоцитов продолжают отмирать после лечения G418, вымойте посуду стерильным PBS для удаления мертвых клеток и добавьте свежую меланоцитарную среду. Посевы меланоцитов и фибробластов следует проводить при достижении ими 70-80% конфлюенции.
