Рекомбинантный препарат вириона на основе полиомавируса клеток Меркеля (MCPyV): способ получения рекомбинантного вириона MCPyV с высоким титром

Аннотация

Источник: Вэй Лю и др. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы показываем приготовление полиомавируса клеток Меркеля или вирионов MCPyV с использованием клеток 273TT. Эта технология позволяет получать высокий титр рекомбинантных вирионов MCPyV.

Протокол

1. Рекомбинантный препарат вириона MCPyV

1. Расщепите 50 г плазмиды pR17b (несущей геном MCPyV) с 250 U BamHI-HF в объеме 200 мкл (4 ч при 37 °C) для отделения вирусного генома от основы вектора (Рисунок 1).
2. Добавьте 1200 μL буферного PB (с добавлением 10 μL 3 M NaAc, pH 5,2) к расщепленной ДНК и очистите в 2 спиновых колонках miniprep (емкость ДНК 20 μg). Разбавленную плазмиду pR17b из каждой колонки 200 мкл TE-буфера (10 мМ Tris-HCl, pH8.0, 1 мМ ЭДТА).
3. Приготовьте реакцию лигирования в центрифужной пробирке объемом 50 мл. Добавьте 400 мкл очищенной плазмидной ДНК из стадии 1.2, 8,6 мл 1,05x Т4-лигазного....

Результаты

Рисунок 1. Получение вириона MCPyV с использованием рекомбинантного вирусного генома.(A) Плазмидная карта pR17b (плазмида генома MCPyV). (B) Репрезентативное изображение образца вириона MCPyV, собранного и очищенного по градиенту. Стрелкой отмечена полоса вирионов MCPyV, сосредоточенных в ядре градиента. (C) Количество копий вирусного генома в каждой.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Средний DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11330-032
Рекомбинантный человеческий белок EGF, CF	Системы НИОКР	236-ЭГ-200	Хранить при температуре -80 градусов Цельсия
CHIR99021	Кайман Кемикал	13122	Хранить при температуре -80 градусов Цельсия
CHIR99021	сигма	SML1046	Хранить при температуре -80 градусов Цельсия
Коллагеназа IV типа	Thermo Fisher Scientific	17104019
Диспаза II	Рош	4942078001
Антибиотик-антимикотик	Thermo Fisher Scientific	15240-062	Беречь от света
Среда DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965084
Параформальдегид	сигма	П6148
Анти-MCPyV LT (CM2B4)	Санта-Крус	СК-136172	Лот # B2717
Кролик MCV VP1		Кролик поликлональная сыворотка #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm