Рекомбинантный препарат вириона на основе полиомавируса клеток Меркеля (MCPyV): способ получения рекомбинантного вириона MCPyV с высоким титром

Аннотация

Источник: Вэй Лю и др. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы показываем приготовление полиомавируса клеток Меркеля или вирионов MCPyV с использованием клеток 273TT. Эта технология позволяет получать высокий титр рекомбинантных вирионов MCPyV.

Протокол

1. Рекомбинантный препарат вириона MCPyV

1. Расщепите 50 г плазмиды pR17b (несущей геном MCPyV) с 250 U BamHI-HF в объеме 200 мкл (4 ч при 37 °C) для отделения вирусного генома от основы вектора (Рисунок 1).
2. Добавьте 1200 μL буферного PB (с добавлением 10 μL 3 M NaAc, pH 5,2) к расщепленной ДНК и очистите в 2 спиновых колонках miniprep (емкость ДНК 20 μg). Разбавленную плазмиду pR17b из каждой колонки 200 мкл TE-буфера (10 мМ Tris-HCl, pH8.0, 1 мМ ЭДТА).
3. Приготовьте реакцию лигирования в центрифужной пробирке объемом 50 мл. Добавьте 400 мкл очищенной плазмидной ДНК из стадии 1.2, 8,6 мл 1,05x Т4-лигазного буфера и 6 мкл Т4-лигазы высокой концентрации. Инкубировать при 16 °C в течение ночи.
4. Добавьте 45 мл буферного PB (с добавлением 10 мкл 3 M NaAc, pH 5,2) к лигированию и используйте вакуумный коллектор для загрузки через 2 спиновые колонки miniprep. Разбавьте каждую колонку 50 мкл TE-буфера. Ожидайте выход около 30 мкг ДНК.
5. Ближе к вечеру/вечером высейте 6 x 10⁶ 293TT клеток в 10-сантиметровую чашку, содержащую среду DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% заменимых аминокислот и 1% L-глутамина без гигромицина B.
6. На следующее утро убедитесь, что клетки сливаются примерно на 50%. Трансфектируют с использованием 66 мкл трансфекционного реагента (1,1 мкл/^см2), 12 мкг религированного изолята MCPyV R17b ДНК из стадии 1.4, 8,4 мкг плазмиды экспрессии ST pMtB и 9,6 мкг экспрессии LT плазмиды pADL.
7. Когда трансфицированные клетки почти сливаются, на следующий день трипсинизируйте клетки и перенесите их в 15-сантиметровую чашку для продолжения экспансии.
8. При необходимости возьмите небольшое количество клеток 293TT при расширении и выполните окрашивание IF для MCPyV LT (CM2B4) и VP1 (кролик MCV VP1) для определения эффективности трансфекции. На этой стадии могут быть видны ядерные сигналы LT, но экспрессия VP1, вероятно, не будет обнаружена.
9. Когда 15-сантиметровая чашка станет почти сливающейся (обычно через 5-6 дней после первоначальной трансфекции), переложите клетки в три 15-сантиметровые чашки. Соберите клетки из 15-сантиметровых чашек, когда они почти сливаются, и следуйте приведенному ниже протоколу сбора вирусов.
   заметка: При необходимости выполните контроль качества ЕСЛИ, как описано в шаге 1.8. На этой стадии большинство клеток должны быть положительными как на MCPyV LT, так и на VP1.
10. Чтобы собрать вирус, трипсинизировать клетки, вращать при 180 x g в течение 5 минут при RT и удалить надосадочную жидкость. Добавьте объем одной клеточной гранулы DPBS-Mg (DPBS с 9,5 мМ MgCl₂ и 1x антибиотиком-антимикотиком). Затем добавьте 25 мМ сульфата аммония (из 1 М стокового раствора pH 9), затем 0,5% Triton X-100 (из 10% исходного раствора), 0,1% бензоназы и 0,1% АТФ-зависимой ДНКазы. Хорошо перемешайте и выдерживайте при температуре 37 °C в течение ночи.
11. Выдержать смесь в течение 15 минут на льду, а затем добавить 0,17 объема 5М NaCl. Перемешайте и выдержите на льду еще 15 минут. Отжим в течение 10 минут при 12 000 x g в центрифуге при температуре 4 °C. Если надосадочная жидкость непрозрачная, аккуратно переверните трубку и повторите этап прядения. Переложите надосадочную жидкость в новую трубку.
12. Повторно суспендируйте гранулу с помощью одного объема DPBS с добавлением 0,8 М NaCl и снова открутите, как описано в шаге 1.11.
13. Объедините надосадочную жидкость из шагов 1.11 и 1.12 и прокрутите еще один раз, как описано в шаге 1.11.
14. Налейте градиент йодиксанола в тонкостенные полиалломеровые пробирки объемом 5 мл с шагом подложки (27%, затем 33%, затем 39%) ~0,7 мл с помощью шприца объемом 3 мл с длинной иглой или пипеткой p1000.
15. Загрузите 3 мл осветленного вируссодержащего надосадочной жидкости на приготовленный градиент йодиксанола.
16. Вращение в течение 3,5 ч при 234 000 x g и 16 °C в роторе SW55ti. Установите ускорение и замедление в положение «Медленно».
17. После ультрацентрифугирования соберите 12 фракций в силиконизированные пробирки (каждая фракция ~400 мкл).
18. Анализируйте фракции на наличие вируса с помощью реагента дцДНК и/или вестерн-блоттинга для VP1 (кролик MCV VP1). Объедините градиентные фракции с пиковым содержанием дцДНК и/или VP1 и охарактеризуйте запас с помощью количественной ПЦР для расчета эквивалента вирусного генома. Храните массу вирионов MCPyV при температуре -80 °C.

Результаты

Рисунок 1. Получение вириона MCPyV с использованием рекомбинантного вирусного генома.(A) Плазмидная карта pR17b (плазмида генома MCPyV). (B) Репрезентативное изображение образца вириона MCPyV, собранного и очищенного по градиенту. Стрелкой отмечена полоса вирионов MCPyV, сосредоточенных в ядре градиента. (C) Количество копий вирусного генома в каждой...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Средний DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11330-032
Рекомбинантный человеческий белок EGF, CF	Системы НИОКР	236-ЭГ-200	Хранить при температуре -80 градусов Цельсия
CHIR99021	Кайман Кемикал	13122	Хранить при температуре -80 градусов Цельсия
CHIR99021	сигма	SML1046	Хранить при температуре -80 градусов Цельсия
Коллагеназа IV типа	Thermo Fisher Scientific	17104019
Диспаза II	Рош	4942078001
Антибиотик-антимикотик	Thermo Fisher Scientific	15240-062	Беречь от света
Среда DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965084
Параформальдегид	сигма	П6148
Анти-MCPyV LT (CM2B4)	Санта-Крус	СК-136172	Лот # B2717
Кролик MCV VP1		Кролик поликлональная сыворотка #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm