Визуализация экспрессии белка на основе CUBIC: процедура визуализации экспрессии белка при биопсии кожи мыши полной толщины

Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка прозрачной ткани кожи мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Все мыши, использованные в этом исследовании, имели генетический фон C57BL/6

1. Сбор тканей кожи мыши.
   1. Гуманно усыплять мышей путем вывиха шейки матки.
   2. Осторожно удалите волоски с соответствующего участка кожи с помощью триммера, стараясь не ранить кожу.
   3. Промойте кожу для обеззараживания 70% этанолом в фосфатно-солевом буфере (PBS).
   4. Подтяните кожу тыльной стороны шеи с помощью щипцов и сделайте разрез ножницами.
   5. Рассеките большой участок спинной кожи мыши (примерно 1,5 х 4 см).
   6. Разровняйте кожу дермой вниз на фильтровальной бумаге и обратите внимание на передне-заднюю ориентацию образца.
   7. Обрежьте рассеченную кожу фильтровальной бумагой и поместите в пробирку объемом 15 мл, наполненную свежеприготовленным 4% раствором параформальдегида (PFA) в PBS.
   8. Зафиксируйте на 1 час при комнатной температуре, либо на ночь в холодильнике при температуре 4 °C.
   9. Промойте кожу 2x 5 мин в PBS в пробирке объемом 15 мл.
      заметка: Следующие действия (1.1.10 - 1.1.12) являются необязательными для долгосрочного хранения ткани.
   10. Обезвоживайте рассеченную кожу в PBS с увеличением концентрации этанола (25%, 50%, 70%) в пробирке объемом 15 мл во время 1-часового умывания, при комнатной температуре.
   11. Храните обезвоженную кожу в 70% этаноле в PBS в пробирке объемом 15 мл при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
   12. За четыре часа до очищения регидратируйте кожную ткань в PBS с уменьшающейся концентрацией этанола (70%, 50%, 25%, 0%) в пробирке объемом 15 мл во время 1-часового мытья при комнатной температуре.
2. Очистка биопсии кожи мыши
   1. Приготовьте раствор для очистки CUBIC1, растворив 3,85 г мочевины и 3,85 г N,N,N'тетракиса (2-гидроксипропил) этилендиамина в 5,38 мл дистиллированной воды на нагревателе, установленном на 60-70 °C. Используйте горячую мешалку.
   2. Добавьте 2,31 г моно--изооктилфенилового эфира полиэтиленгликоля/Triton X-100 в раствор, когда он станет прозрачным и остынет до комнатной температуры.
   3. Разрежьте кожу мыши острым лезвием бритвы на биопсию приблизительных размеров 0,2 х 0,5 см и погрузите в 5 мл очищающего раствора CUBIC1 в пробирку объемом 15 мл. Чтобы оптимизировать визуализацию волосяных фолликулов, убедитесь, что длинная сторона биопсии разрезана вдоль передне-заднего направления образца.
   4. Поместите на вращающуюся платформу в печь для гибридизации при температуре 37 °C.
   5. Измените раствор для очистки через 7 дней. Перед использованием приготовьте свежий раствор CUBIC1.
   6. Проверьте прозрачность ткани через 7 дней. При необходимости оставьте биопсию в очищающем растворе CUBIC1 до тех пор, пока ткань не станет полностью прозрачной.
   7. Как только биопсия кожи станет прозрачной, удалите раствор CUBIC1 и добавьте 4 мл 1x PBS для промывания ткани 4 раза в течение 6 часов при 37 °C.
   8. Промойте кожную ткань в 20% w/v сахарозе в PBS в пробирке объемом 15 мл в течение 4 часов при 37 °C.
   9. Заморозьте салфетку в компаунде оптимальной температуры резки (OCT) в пробирке объемом 15 мл на ночь в морозильной камере при температуре -80 °C. < бр /> заметка: Этот шаг повысит проницаемость биопсии для проникновения антител на последующих этапах.

2. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Разморозьте ткань от (шаг 1.2.9) до комнатной температуры в течение 2 - 3 часов.
2. Промойте ткань в пробирке объемом 15 мл 5 мл PBS в течение 8 часов при комнатной температуре, чтобы удалить соединение OCT.
3. Перенесите биопсию в пробирку объемом 2 мл и инкубируйте ткань в 1 мл антитела кролика против Keratin14 или антитела кролика против Ki67, разведенных в соотношении 1:100 в PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) в течение 3 дней в шейкере в духовке при температуре 37 °C.
4. Перенесите биопсию в пробирку объемом 15 мл и промойте ткань 4 раза в течение 6 часов в 5 мл PBST в шейкере в духовке при температуре 37 °C.
5. Перенесите биопсию в пробирку объемом 2 мл, добавьте 1 мл вторичного антитела против кролика Alexa594, разведенного в соотношении 1:100 в PBST, и инкубируйте 3 дня на шейкере в духовке при температуре 37 °C.
6. Перенесите биопсию в трубку объемом 15 мл и промойте ткань 4 раза в течение 6 часов в 5 мл PBST на шейкере в духовке при температуре 37 °C.
7. Перенесите биопсию в пробирку объемом 2 мл, добавьте 1 мл раствора ядерного противокрасителя 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (1:1,000) в PBST и инкубируйте в течение ночи в шейкере в духовке при температуре 37 °C.
8. Удалите противозагрязняющий раствор DAPI и добавьте 1 мл PBST в тюбик объемом 2 мл для 4 промывки салфетки в течение 6 часов на шейкере в духовке при температуре 37 °C. <бр /> заметка: Необязательный шаг: биопсию можно хранить в темноте в 1x PBS с 0,02% азидом натрия не менее 3 недель.

3. Визуализация

1. Приготовьте очищающий раствор CUBIC2, который содержит 50% сахарозы, 25% мочевины, 10% 2,2,2,2''-нитрилотриэтанола и 0,1% (v/v) Triton X-100.
2. Инкубировать кожную ткань в 1 мл раствора CUBIC2 в пробирке объемом 2 мл на шейкере в течение 24 часов в духовке при температуре 37 °C. Этот шаг приведет к выравниванию показателя преломления ткани.
3. Проверьте прозрачность ткани. Как только она станет прозрачной, поместите всю биопсию кожи (0,2 x 0,5 см) на ее более длинную сторону на стеклянную покровную накладку таким образом, чтобы направление длины волосяных фолликулов было параллельно поверхности покровного стекла (#1 24 x 60 мм).
   заметка: Дополнительный этап: Биопсия, окрашенная антителами, может храниться в растворе CUBIC2 около 7 дней. Биопсия, окрашенная в красный цвет Нила, может храниться в растворе CUBIC2 только в течение 1 дня и должна быть визуализирована как можно скорее.
4. Подготовьте камеру визуализации (Рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расходные материалы, необходимые для подготовки камеры визуализации: синяя прихватка, пластилин или аналогичный, а также 2 покровных стекла (24 x 50 мм) (Рисунок 1A).
   1. Подготовьте две тонкие полоски синей прихватки (диаметр примерно 1 мм х 2 см) и два покровных стекла (рисунок 1B).
   2. Поместите синие полоски на одну защитную полоску, оставив достаточно места для биопсии кожи (рис. 1C, шаг 3.4.3).
   3. Поместите биопсию кожи между полосками на покровном стеколе в каплю раствора CUBIC2 (рисунок 1C).
   4. Покровная биопсия кожи с помощью второго покровного стекла (Рисунок 1D).
5. Поместите камеру визуализации с установленной биопсией кожи на предметный столик конфокального микроскопа и переместите ткань в световой путь.
6. Отсканируйте образец с помощью ртутного или галогенного источника света и стандартных эпифлуоресцентных фильтров (например, DAPI/GFP/CY3/CY5), чтобы определить флуоресцентно окрашенные области, представляющие интерес.
7. Области изображения, представляющие интерес, с использованием объектива 10X и 20X (NA 0,75) и стандартных методов конфокальной флуоресцентной визуализации (например, с окрашенными образцами DAPI освещаются лазером с длиной волны 405 нм и собирают флуоресцентный сигнал в диапазоне 425-475 нм, а с помощью окрашенных образцов Alexa Fluor 594 или Nile Red освещаются лазером с длиной волны 561 нм и собирают флуоресцентный сигнал в диапазоне 570-620 нм).
8. Создание Z-стеков изображений для каждой области интереса с помощью программного обеспечения для получения изображений Z-стека микроскопа (например, с помощью программного обеспечения для визуализации элементов NIS 4.13, как описано ниже).
   1. Обеспечьте оптимальную мощность лазера и выберите настройки PMT HV/Offset для сбора флуоресценции образца.
   2. Откройте панель инструментов "ND Acquisition" в меню "Capture Controls".
   3. Выберите вкладку «Настройка серии Z» (убедитесь, что все остальные вкладки не выбраны).
   4. Во время сканирования в реальном времени сфокусируйтесь на верхней части образца и нажмите кнопку «Top».
   5. Сфокусируйтесь на нижней части образца и нажмите кнопку "Bottom".
   6. Введите требуемый размер шага (или нажмите кнопку оптимизированного размера шага).
   7. Нажмите кнопку "Run Now".
   8. Сохраняйте полученные Z-стеки в виде отдельных стеков изображений Tiff (1 флуорохром на изображение, Z-стек).
9. Используйте Z-стеки изображений для реконструкции интересующих областей 3D-объема с помощью программного обеспечения для 3D-анализа (например, с помощью Imaris x64 7.2.3, как описано ниже).
   1. Запустите программное обеспечение для анализа.
   2. Выберите кнопку «Превзойти» на панели инструментов для создания 3D-объема.
   3. Откройте первое цветное изображение Z-stack (например, DAPI).
   4. Используйте инструмент «Добавить канал», чтобы добавить дополнительные цветовые каналы, по одному каналу на флуорохром. Таким образом, для образца, содержащего флуорохромы DAPI и Alexa Fluor 594, потребуется два канала.
   5. Используйте инструмент "Свойства изображения" для установки правильных размеров пикселя (вокселя) (XYZ), как определено в пункте 3.7 выше.
   6. Используйте инструмент «Настройка дисплея», чтобы изменить цвета канала по мере необходимости (например, установите синий цвет канала DAPI, красный — канал Alexa Fluor 594).
   7. Чтобы разместить 3D-объем в окне изображения, используйте компьютерную мышь, чтобы щелкнуть и перетащить объем по мере необходимости.
   8. Используйте инструмент «Снимок» на панели инструментов для создания скриншотов 3D-изображения.
   9. Используйте инструмент "Анимация" на панели инструментов для создания видеороликов с вращением 3D сэмплов.

Рисунок 1: Подготовка камеры визуализации. О: Расходные материалы, необходимые для подготовки камеры визуализации, - это синяя прихватка, пластилин или что-то подобное, а также 2 покровных стекла (24 x 50 мм). Б: Подготовьте две тонкие полоски синей прихватки (диаметр примерно 2 мм х 2 см) и два покровных листа. В: Наклейте синие полоски на один покровный лист, оставив достаточно места для биопсии кожи. Поместите биопсию кожи в каплю раствора CUBIC2 между двумя полосками. D: Наденьте второй покровный лист на синие полоски, чтобы закрыть биопсию кожи.