Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Подготовка прозрачной ткани кожи мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Все мыши, использованные в этом исследовании, имели генетический фон C57BL/6
- Сбор тканей кожи мыши.
- Гуманно усыплять мышей путем вывиха шейки матки.
- Осторожно удалите волоски с соответствующего участка кожи с помощью триммера, стараясь не ранить кожу.
- Промойте кожу для обеззараживания 70% этанолом в фосфатно-солевом буфере (PBS).
- Подтяните кожу тыльной стороны шеи с помощью щипцов и сделайте разрез ножницами.
- Рассеките большой участок спинной кожи мыши (примерно 1,5 х 4 см).
- Разровняйте кожу дермой вниз на фильтровальной бумаге и обратите внимание на передне-заднюю ориентацию образца.
- Обрежьте рассеченную кожу фильтровальной бумагой и поместите в пробирку объемом 15 мл, наполненную свежеприготовленным 4% раствором параформальдегида (PFA) в PBS.
- Зафиксируйте на 1 час при комнатной температуре, либо на ночь в холодильнике при температуре 4 °C.
- Промойте кожу 2x 5 мин в PBS в пробирке объемом 15 мл.
заметка: Следующие действия (1.1.10 - 1.1.12) являются необязательными для долгосрочного хранения ткани.
- Обезвоживайте рассеченную кожу в PBS с увеличением концентрации этанола (25%, 50%, 70%) в пробирке объемом 15 мл во время 1-часового умывания, при комнатной температуре.
- Храните обезвоженную кожу в 70% этаноле в PBS в пробирке объемом 15 мл при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
- За четыре часа до очищения регидратируйте кожную ткань в PBS с уменьшающейся концентрацией этанола (70%, 50%, 25%, 0%) в пробирке объемом 15 мл во время 1-часового мытья при комнатной температуре.
- Очистка биопсии кожи мыши
- Приготовьте раствор для очистки CUBIC1, растворив 3,85 г мочевины и 3,85 г N,N,N'тетракиса (2-гидроксипропил) этилендиамина в 5,38 мл дистиллированной воды на нагревателе, установленном на 60-70 °C. Используйте горячую мешалку.
- Добавьте 2,31 г моно--изооктилфенилового эфира полиэтиленгликоля/Triton X-100 в раствор, когда он станет прозрачным и остынет до комнатной температуры.
- Разрежьте кожу мыши острым лезвием бритвы на биопсию приблизительных размеров 0,2 х 0,5 см и погрузите в 5 мл очищающего раствора CUBIC1 в пробирку объемом 15 мл. Чтобы оптимизировать визуализацию волосяных фолликулов, убедитесь, что длинная сторона биопсии разрезана вдоль передне-заднего направления образца.
- Поместите на вращающуюся платформу в печь для гибридизации при температуре 37 °C.
- Измените раствор для очистки через 7 дней. Перед использованием приготовьте свежий раствор CUBIC1.
- Проверьте прозрачность ткани через 7 дней. При необходимости оставьте биопсию в очищающем растворе CUBIC1 до тех пор, пока ткань не станет полностью прозрачной.
- Как только биопсия кожи станет прозрачной, удалите раствор CUBIC1 и добавьте 4 мл 1x PBS для промывания ткани 4 раза в течение 6 часов при 37 °C.
- Промойте кожную ткань в 20% w/v сахарозе в PBS в пробирке объемом 15 мл в течение 4 часов при 37 °C.
- Заморозьте салфетку в компаунде оптимальной температуры резки (OCT) в пробирке объемом 15 мл на ночь в морозильной камере при температуре -80 °C. < бр />
заметка: Этот шаг повысит проницаемость биопсии для проникновения антител на последующих этапах.
2. Иммунофлуоресцентное окрашивание
- Разморозьте ткань от (шаг 1.2.9) до комнатной температуры в течение 2 - 3 часов.
- Промойте ткань в пробирке объемом 15 мл 5 мл PBS в течение 8 часов при комнатной температуре, чтобы удалить соединение OCT.
- Перенесите биопсию в пробирку объемом 2 мл и инкубируйте ткань в 1 мл антитела кролика против Keratin14 или антитела кролика против Ki67, разведенных в соотношении 1:100 в PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) в течение 3 дней в шейкере в духовке при температуре 37 °C.
- Перенесите биопсию в пробирку объемом 15 мл и промойте ткань 4 раза в течение 6 часов в 5 мл PBST в шейкере в духовке при температуре 37 °C.
- Перенесите биопсию в пробирку объемом 2 мл, добавьте 1 мл вторичного антитела против кролика Alexa594, разведенного в соотношении 1:100 в PBST, и инкубируйте 3 дня на шейкере в духовке при температуре 37 °C.
- Перенесите биопсию в трубку объемом 15 мл и промойте ткань 4 раза в течение 6 часов в 5 мл PBST на шейкере в духовке при температуре 37 °C.
- Перенесите биопсию в пробирку объемом 2 мл, добавьте 1 мл раствора ядерного противокрасителя 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (1:1,000) в PBST и инкубируйте в течение ночи в шейкере в духовке при температуре 37 °C.
- Удалите противозагрязняющий раствор DAPI и добавьте 1 мл PBST в тюбик объемом 2 мл для 4 промывки салфетки в течение 6 часов на шейкере в духовке при температуре 37 °C. <бр />
заметка: Необязательный шаг: биопсию можно хранить в темноте в 1x PBS с 0,02% азидом натрия не менее 3 недель.
3. Визуализация
- Приготовьте очищающий раствор CUBIC2, который содержит 50% сахарозы, 25% мочевины, 10% 2,2,2,2''-нитрилотриэтанола и 0,1% (v/v) Triton X-100.
- Инкубировать кожную ткань в 1 мл раствора CUBIC2 в пробирке объемом 2 мл на шейкере в течение 24 часов в духовке при температуре 37 °C. Этот шаг приведет к выравниванию показателя преломления ткани.
- Проверьте прозрачность ткани. Как только она станет прозрачной, поместите всю биопсию кожи (0,2 x 0,5 см) на ее более длинную сторону на стеклянную покровную накладку таким образом, чтобы направление длины волосяных фолликулов было параллельно поверхности покровного стекла (#1 24 x 60 мм).
заметка: Дополнительный этап: Биопсия, окрашенная антителами, может храниться в растворе CUBIC2 около 7 дней. Биопсия, окрашенная в красный цвет Нила, может храниться в растворе CUBIC2 только в течение 1 дня и должна быть визуализирована как можно скорее.
- Подготовьте камеру визуализации (Рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Расходные материалы, необходимые для подготовки камеры визуализации: синяя прихватка, пластилин или аналогичный, а также 2 покровных стекла (24 x 50 мм) (Рисунок 1A).
- Подготовьте две тонкие полоски синей прихватки (диаметр примерно 1 мм х 2 см) и два покровных стекла (рисунок 1B).
- Поместите синие полоски на одну защитную полоску, оставив достаточно места для биопсии кожи (рис. 1C, шаг 3.4.3).
- Поместите биопсию кожи между полосками на покровном стеколе в каплю раствора CUBIC2 (рисунок 1C).
- Покровная биопсия кожи с помощью второго покровного стекла (Рисунок 1D).
- Поместите камеру визуализации с установленной биопсией кожи на предметный столик конфокального микроскопа и переместите ткань в световой путь.
- Отсканируйте образец с помощью ртутного или галогенного источника света и стандартных эпифлуоресцентных фильтров (например, DAPI/GFP/CY3/CY5), чтобы определить флуоресцентно окрашенные области, представляющие интерес.
- Области изображения, представляющие интерес, с использованием объектива 10X и 20X (NA 0,75) и стандартных методов конфокальной флуоресцентной визуализации (например, с окрашенными образцами DAPI освещаются лазером с длиной волны 405 нм и собирают флуоресцентный сигнал в диапазоне 425-475 нм, а с помощью окрашенных образцов Alexa Fluor 594 или Nile Red освещаются лазером с длиной волны 561 нм и собирают флуоресцентный сигнал в диапазоне 570-620 нм).
- Создание Z-стеков изображений для каждой области интереса с помощью программного обеспечения для получения изображений Z-стека микроскопа (например, с помощью программного обеспечения для визуализации элементов NIS 4.13, как описано ниже).
- Обеспечьте оптимальную мощность лазера и выберите настройки PMT HV/Offset для сбора флуоресценции образца.
- Откройте панель инструментов "ND Acquisition" в меню "Capture Controls".
- Выберите вкладку «Настройка серии Z» (убедитесь, что все остальные вкладки не выбраны).
- Во время сканирования в реальном времени сфокусируйтесь на верхней части образца и нажмите кнопку «Top».
- Сфокусируйтесь на нижней части образца и нажмите кнопку "Bottom".
- Введите требуемый размер шага (или нажмите кнопку оптимизированного размера шага).
- Нажмите кнопку "Run Now".
- Сохраняйте полученные Z-стеки в виде отдельных стеков изображений Tiff (1 флуорохром на изображение, Z-стек).
- Используйте Z-стеки изображений для реконструкции интересующих областей 3D-объема с помощью программного обеспечения для 3D-анализа (например, с помощью Imaris x64 7.2.3, как описано ниже).
- Запустите программное обеспечение для анализа.
- Выберите кнопку «Превзойти» на панели инструментов для создания 3D-объема.
- Откройте первое цветное изображение Z-stack (например, DAPI).
- Используйте инструмент «Добавить канал», чтобы добавить дополнительные цветовые каналы, по одному каналу на флуорохром. Таким образом, для образца, содержащего флуорохромы DAPI и Alexa Fluor 594, потребуется два канала.
- Используйте инструмент "Свойства изображения" для установки правильных размеров пикселя (вокселя) (XYZ), как определено в пункте 3.7 выше.
- Используйте инструмент «Настройка дисплея», чтобы изменить цвета канала по мере необходимости (например, установите синий цвет канала DAPI, красный — канал Alexa Fluor 594).
- Чтобы разместить 3D-объем в окне изображения, используйте компьютерную мышь, чтобы щелкнуть и перетащить объем по мере необходимости.
- Используйте инструмент «Снимок» на панели инструментов для создания скриншотов 3D-изображения.
- Используйте инструмент "Анимация" на панели инструментов для создания видеороликов с вращением 3D сэмплов.
