Генетическая модификация первичных кератиноцитов человека: метод генетической манипулирования кератиноцитами с помощью рекомбинантных ретровирусов

Аннотация

Источник: Li, J. et al. Поколение генетически модифицированных органотипических культур кожи с использованием девитализированной дермы человека. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео описывает подробный протокол производства генетически модифицированного первичного рекомбинантного ретровируса кератиноцитов человека. Этот метод может быть использован для манипулирования экспрессией генов в кератиноцитах.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Генетическая модификация первичных кератиноцитов человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте амфотропные клетки феникса, выращенные в полной среде DMEM [DMEM + 10% фетальная бычья сыворотка (FBS) + ручка/стрептококк] для производства вирусов для заражения первичных кератиноцитов человека. Гены упаковки вируса, кодирующие такие белки, как gag-pol и envelope, стабильно интегрированы в геном клетки феникса, что позволяет производить вирус при трансфекции ретровирусным вектором. Клетки феникса могут быть трансфицированы с высокой эффективностью, что обеспечивает высокую выработку титра вируса. Вирусы, произведенные на этой упаковочной линии, также могут инфицировать большое количество клеток млекопитающих, включая человека.

1. День 1: За день до трансфекции засейте клетки феникса в 6-луночной пластине с плотностью 800 000 клеток на лунку в полной среде DMEM.
2. День 2: В день трансфекции, используйте 3 мкг ретровирусных векторов на лунку. Аликвота 3 мкг ретровирусного вектора в пробирку объемом 1,5 мл. Используйте смесь 100 μL DMEM плюс 6 μL реагента для трансфекции на каждые 3 μг вектора. Смешайте 6 мкл трансфекционного реагента со 100 мкл DMEM в пробирке объемом 1,5 мл. (Используемые ретровирусные векторы перечислены в таблице оборудования/материалов)
   1. Инкубировать в течение 5 минут и добавить смесь объемом 106 мкл в предварительно аликвотированную пробирку, содержащую 3 мкг ретровирусного вектора. Перемешайте и инкубируйте при RT в течение 30 минут. Добавьте всю эту смесь по каплям в каждую лунку клеток феникса.
3. День 3: На следующий день после трансфекции удалите среду из клеток феникса и добавьте 2 мл свежей полной среды DMEM. В тот же день засейте первичные кератиноциты человека в 6-луночные планшеты с плотностью 75 000 клеток на лунку. Поддерживайте кератиноциты в свободной среде кератиноцитов в сыворотке крови (KCSFM) с помощью антибиотиков (пен/стрептококк).
   заметка: Были приобретены первичные кератиноциты человека. Ячейки можно приобрести у различных поставщиков (перечислены в таблице «Материалы»).
4. День 4: Соберите среду из трансфицированных клеток феникса, которые теперь содержат вирусные частицы. Пропустите среду через фильтр 0,45 мкм с помощью шприца (для удаления любых загрязняющих клеток феникса) и поместите 2 мл на кератиноциты (75 000 клеток/лунка в предыдущий день). Добавьте гексадиметрина бромид (5 мкг/мл) в среду, чтобы помочь опосредовать процесс инфекции. Титры вируса составляют ~1 x 10⁷ TU/мл.
   1. Вращайте 6-луночные планшеты в центрифуге при температуре 200 x g в течение 1 часа при RT. После отжима удалите среду, содержащую вирус, и промойте клетки один раз 1x PBS перед добавлением KCSFM.
5. День 5: Повторно инфицируйте ту же партию кератиноцитов, что и в 1,4, используя 2 мл фильтрованной среды, содержащей гексадиметрина бромид (5 мкг/мл). Открутите его при 200 x g в течение 1 часа при RT, чтобы удалить среду, содержащую вирусы, и промойте 1x PBS, затем добавьте KCSFM.
   заметка: Выберите кератиноциты с помощью препарата, если на ретровирусном векторе есть селективный маркер, и разверните для использования в последующем анализе или в таких приложениях, как органотипические культуры.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Амфотропные клеточные линии феникса	АТКС	КРЛ-3213
Реагент для трансфекции FUGENE 6	Компания Promega	Е2691
Кератиноцитарные среды (KCSFM)	Технологии Life	17005042
DMEM	GIBCO	11995
Неонатальные кератиноциты человека	АТКС	ПКС-200-010
Неонатальные кератиноциты человека	Применение ячеек	102К-05Н
Ретровирусный вектор MSCV	Клонтех	634401
Ретровирусный вектор ЛЗРС	Адджен
pSuper.Retro.Puro Retroviral вектор	Олигодвигатель	ВЕК-ПРТ-0002
гексадиметрина бромид	сигма	Н9268-5Г
ФБС	GIBCO	10437-028 (Английский)
РУЧКА/СТРЕПТОКОКК	GIBCO	15140-122

г.