Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Сбор и посев первичных кератиноцитов
- Усыпьте от четырех до пяти взрослых самок мышей с помощью ингаляцииCO2 в соответствии с утвержденными стандартами животноводческих помещений / IACUC. Тем не менее, этот протокол также может быть использован для одиночных самок/самцов мышей.
- Подстригите примерно 9 см2 спинного меха электрической машинкой для стрижки животных и поместите всех стриженых мышей в банку объемом 500 мл с достаточным количеством антисептического раствора повидон-йода (не скраба), чтобы накрыть их на 1-2 минуты. Хорошо встряхните банку, чтобы равномерно покрыть мышей антисептическим раствором.
- Слейте раствор и смойте чистой водой, пока жидкость не станет прозрачной. Повторите ту же антисептическую полоскание с последующим промыванием водой. После промывки антисептиком раствором йода замочите всех мышей в 70% этаноле на 5-10 мин.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши со светлым мехом (например, BALB/c) сохраняют легкий желтоватый цвет от антисептических растворов йодом, в то время как более темные мыши (например, C57BL/6) не сохраняют. Примечательно, что желтый цвет не влияет на жизнеспособность клеток или рост культуры.
- Осторожно удалите подстриженную спинную кожу с помощью щипцов для большого пальца и ножниц в капюшоне с ламинарным потоком. Поместите иссеченную спинную кожу в коническую трубку, наполненную PBS/2x гентамицином. Избегайте использования вентральной боковой кожи для предотвращения загрязнения клеток молочной железы в культуре.
- Используя автоклавные щипцы и скальпель, поместите по одной тыльной стороне кожи волосистой стороной вниз на тонкую чашку Петри. Начните соскабливать всю подкожную клетчатку, включая жир с вентральной стороны кожной ткани, пока она не станет полупрозрачной. Постарайтесь удалить максимум следов подкожной клетчатки, не разрывая кожу (волосяную часть фолликула). Также не стоит долго соскабливать и не допускать пересыхания кожи.
- Соскобленную кожу держать в растворе PBS до тех пор, пока не будут обработаны все остальные шкуры. Затем с помощью скальпеля нарежьте шкуру полосками размером 0,5 см х 1-1,5 см и положите волосистой стороной вверх на стерильную чашку Петри.
- Осторожно нанесите пипеткой 20 мл раствора PBS/2x Gentamicin, смешанного с трипсином (0,25%) в пластиковую чашку Петри размером 100 мм x 20 мм. С помощью стерильных щипцов переложите кожицу и поместите ее волосатой стороной вверх на поверхность раствора трипсина в течение 2 ч в инкубаторе при температуре 32 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время и температура трипсинизации имеют решающее значение для хорошего выхода высококультивируемых первичных кератиноцитов. Хотя другие методы могут обеспечить хороший выход жизнеспособных клеток, культивируемость кератиноцитов была менее удовлетворительной.
- В течение этого 2-часового времени инкубации накройте чашки коллагеновым покрытием и поместите их при температуре 37 °C на 1 час (см. шаг 1.1.2). Для клоногенных анализов чашки Петри диаметром 60 мм покрывают за 24 ч до забора кератиноцитов, чтобы облученный питательный слой 3T3 мог прикрепиться к дну и равномерно распределить.
заметка: Покрытие культуральных чашек для клоногенной культуры очень важно для правильного прикрепления, образования колоний и конечного роста/пролиферации эпидермальных кератиноцитов мышей.
- Этап соскоба эпидермиса: Установите стерильную пластиковую квадратную чашку Петри и создайте поверхность под углом 30° для правильного соскоба эпидермиса с помощью 15 мл среды для сбора (см. Таблицу 1). Аккуратно удалите плавающую полоску кожи из раствора трипсина изогнутыми щипцами. Затем с помощью нового лезвия скальпеля соскребите эпидермис и волоски в среду.
- Не применяйте чрезмерную силу, но используйте достаточную силу, чтобы соскоблить эпидермис или повлиять на жизнеспособность клеток.
- Во время выскабливания эпидермиса держите лезвие перпендикулярно кусочку кожи. Если лезвие наклонено в сторону движения лезвия, вероятность разрыва кожи выше. Если лезвие расположено под углом в сторону от движения лезвия, вероятность неполного удаления эпидермиса выше.
- Осторожно налейте среду для сбора, содержащую соскобленные клетки эпидермиса, в стерильную банку объемом 60 мл (автоклавируемую и многоразовую) с помощью 1,5-дюймовой магнитной мешалки. Промойте чашку Петри дополнительной средой для сбора оставшихся клеток эпидермиса и доведите итоговый объем до 30 мл. Используйте магнитную мешалку и перемешивайте при 100 об/мин в течение 20 минут при комнатной температуре. Этот процесс удалит из волос застрявшие клетки эпидермиса.
- Поместите стерильный клеточный фильтр 70 мкм на верхнюю часть конической пробирки объемом 50 мл. Клеточное сетчатое фильтр помещается в верхней части конической трубки объемом 50 мл.
- Поместите банку в колпак с биозащитой. Снимите мешалку и вылейте содержимое в фильтр-фильтр, прикрепленный к конической трубке объемом 50 мл. Процедите нежелательные волосы и листы рогового слоя.
- Сожмите волоски вместе с материалами рогового слоя внутри ситечка и манипулируйте ими, чтобы освободить захваченные волосяные клетки. Используйте 5 мл питательной среды, чтобы оставшиеся захваченные клетки высвободились и потекли в пробирку. Доведите общий объем до 50 мл в конической пробирке.
- Закройте коническую пробирку объемом 50 мл с фильтратом клеток и центрифугой при температуре 160 x g на 7 минут при температуре 4 °C. Далее аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте 5 мл заготовительной среды. Наконец, повторно суспендируйте клеточную гранулу, осторожно растирая ~20x с помощью пипетки объемом 5 мл.
- На этом этапе храните ячейки в холодильнике, чтобы избежать скопления. Далее добавьте 25 мл среды для сбора урожая и снова растирайте (20-25x).
- Чтобы обеспечить точный подсчет кератиноцитов на этом этапе, возьмите 1 мл клеточной суспензии и добавьте 19 мл собирающей среды. Теперь разведение клеток составляет 1:20 в конической пробирке объемом 50 мл. Если кератиноциты собираются у одной мыши, отрегулируйте объем клеточной суспензии. Например, вместо 30 мл используйте 15 мл и сделайте разведение 1:10 для подсчета клеток.
- Пипировать 0,5 мл разведенных клеток из конической пробирки объемом 50 мл (разведение 1:20) и переложить в автоклавную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Удалите 0,2 мл (200 мкл) клеточной смеси в другую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и добавьте равный объем (200 мкл) 0,4% раствора трипанового синего. Аккуратно перемешайте этот раствор в 3 раза и перенесите клетки в гемоцитометр для подсчета кератиноцитов с ядрами.
- Оцените все темно-синие клетки с положительным результатом на трипановый синий как нежизнеспособные мертвые клетки, а маленькие золотые и розоватые клетки — как жизнеспособные. Таким образом, конечный выход кератиноцитов на одну мышь должен составлять около 30 миллионов жизнеспособных клеток.
- Центрифугируйте исходную коническую пробирку объемом 50 мл (начиная с шага 1,8) в течение 7 минут при 160 x g при 4 °C. На этом этапе ресуспендируйте клетки в нужной среде и сделайте необходимое разведение для затравки клеток.
- Для массового культивирования в каждую чашку Петри диаметром 35 мм в клеточную культуральную среду засеивают от 2 до 4 миллионов жизнеспособных клеток золота (среда типа КГМ + добавки для монослойных культур) (см. табл. 1). Для проведения клоногенного (колониеобразующего) анализа затравливают 1000 клеток на 60 мм чашку Петри на облученных рентгеновскими лучами слоях кормушки 3T3 швейцарской мыши с коллагеновым покрытием и модифицированной средой Willia's E с добавками и сывороткой.
- Используйте в общей сложности от 2 до 4 мл среды для чашек Петри 35 мм и 60 мм соответственно. Кроме того, составьте среду DMEM и Williams E, полученную из ATCC, с пониженным содержанием бикарбоната натрия для использования при 5%CO2.
- Выращивайте клетки культуры (массовые или клоногенные) при 32 °C, влажности 95% и 5%CO2. Меняйте носители через день после первоначального посева для массовой культуры, а затем 3 раза в неделю. Однако для клональных анализов первая смена среды происходит через 2 дня после посева клеток и 3 раза в неделю после этого.
- Для клональной культуры культивируйте клетки с интервалом в две и четыре недели. После завершения клональных культур (2 или 4 недели) отсасывайте среду. Зафиксируйте колонии в 10% буферном формалине на ночь при комнатной температуре и окрашивайте 0,5% родамином В в воде автоклава на 1 ч. Затем удалите пятно от родамина B с помощью пипетки с края посуды.
- Промойте посуду в холодной автоклавной воде, пока посуда не станет прозрачной. Поставьте посуду наклонно на крышку посуды и дайте ей обсохнуть для окончательного подсчета колоний. Следует отметить, что при проведении анализа клоногенных культур никогда не следует пипетировать <1 мл клеток. Если клетки концентрированы, последовательно разбавляйте клеточную концентрацию.
| Решения и медиа | Комментарии |
| Решения для уборки урожая | |
| 2,5% трипсин (5 мл) | |
| PBS Дульбекко (500 мл) | |
| Гентамицин (2 мл) | |
| PBS с 2x гентамицином (45 мл) | |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) с 2x гентамицином | |
| Раствор трипсина | |
| Решения для клеточных культур | |
| Решение для покрытия посуды Purecol-fibronectin: | |
| 1 м HEPES (1 мл) | |
| 116 мМ CaCl2 (1 мл) | |
| Бычий сывороточный альбумин 1,0 мг/мл (10 мл) | |
| Среда для культивирования клеток (100 мл) | |
| Фибронектин (1 мг) | |
| Коллаген Purecol (1 мл) | |
| Решение для заморозки клеток | |
| ДМСО (2 мл) | |
| DMEM с 10% BCS и пен-стрептококком | |
| Уборочная среда | Должен быть без кальция |
| 2x гентамицин (1 мл) | |
| ФБС (50 мл) | |
| SMEM (500 мл) | |
| Е среда Вильямса с высоким содержанием кальция с: | |
| ЭФР (5 мкг/мл) 1 мл | |
| Глутамин 14,5 мл | |
| Гидрокортизон (1 мг/мл) 0,5 мл | |
| Инсулин 1 мл | |
| LinoAcid-BSA (0,1 мг/мл) 0,5 мл | |
| MEM Ess AminoAcids 4 мл | |
| MEM Витамины 5 мл | |
| Пенициллин-стрептомицин 5 мл | |
| Трансферрин (5 мг/мл) 1 мл | |
| Витамин А (1 мг/1 000 μл) 57,5 μл | |
| Vit E 1 мг/мл (4°C) 3,5 мкл | |
| Вит D2 (10 мг/мл) 50 мкл | |
| Полная питательная среда для фибробластов 3T3 (CGM) | |
| БКС (100 мл) | |
| DMEM (900 мл) | |
| Пенициллин-стрептомицин (10 мл) | |
| КГМ | Среда, используемая для массового культивирования, представляет собой среду с пониженным содержанием кальция |
| Моррис 2 медиум с теми же добавками, что и Е Вильямса | Вариант Вильямса Е с пониженным содержанием кальция с добавками |
Таблица 1: Рецепты растворов и сред.
