miniCoopR Векторный трансгенез: метод скрининга генов, индуцирующих меланому, в модели опухоли данио-рерио

Аннотация

Источник: Iyengar, S. et al. Скрининг модификаторов меланомы с использованием модели автохтонной опухоли данио-рерио. J. Vis. Exp. (2012)

В этом видео описывается метод скрининга генов, модифицирующих меланому, с использованием трансгенной модели опухоли данио-рерио. При введении вектора miniCoopR, вызывающего меланому, у рыбок данио развиваются меланомы, и поэтому их можно использовать для изучения генетических факторов, влияющих на развитие опухолей у рыбок данио.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Скрининг модификаторов начала меланомы

1. Создание клонов среднего входа Gateway методом ПЦР, амплигурация полноразмерной открытой рамки считывания интересующих генов (GOI) и рекомбинация в pDONR 221 с использованием BP clonase II (Invitrogen). Используйте технологию Multisite Gateway (Invitrogen) для рекомбинации p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA и miniCoopR для размещения интересующих генов под промотором mitfa в векторе miniCoopR (рис. 1A).
2. Ввести 25 пикограмм каждого клона вместе с 25 пикограммами мРНК Tol2-транспозазы в одноклеточную Tg(mitfa:BRAFV600E); p53(lf); mitfa(lf)трижды гомозиготные эмбрионы данио-рерио, как описано ранее. Инкубируйте введенные эмбрионы при температуре 28,5 °C. Удалите все мертвые эмбрионы при 24 hpf.
3. Выберите трансгенных животных со спасенными меланоцитами при 72 hpf, поместив чашку Петри, содержащую введенные эмбрионы, на препарирующий микроскоп под падающим светом на белом фоне (рис. 1A).
4. Пересадите животных в резервуары объемом 3 л в питомнике питомника для рыбок данио-рерио при температуре 4 dpf.
5. Через 2 месяца отбирают животных с хотя бы одной областью спасения меланоцитов более 4^мм2 (рис. 1А). Существует сильная корреляция между степенью спасения меланоцитов при 72 hpf и степенью спасения меланоцитов через 2 месяца. Когда эмбрионы с спасением меланоцитов отбираются при 72 hpf, большинство из них (~80%) будут иметь по крайней мере одну область спасения меланоцитов размером более 4^мм2 через 2 месяца.
6. Еженедельно проводите скрининг выбранных животных на наличие опухолей (рисунок 1B). Существует сильная корреляция между гистопатологическими и морфологическими изменениями. Переход от доброкачественного к злокачественному распознается как морфологическое изменение, когда поражения приподнимаются над поверхностью животного. Изолируйте опухоленосных животных для исследования.
7. Нарисуйте кривые выживаемости без меланомы с возрастом в неделях на абсциссе и процентом выживаемости без меланомы на ординате. Животных с меланоцитами, экспрессирующими интересующий ген, сравнивают с контрольными животными, экспрессирующими EGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок) в меланоцитах (рис. 1C). Медиана возникновения опухоли у животных, которым вводили miniCoopR-EGFP, составляет примерно 18 недель. Определите, являются ли эти две кривые статистически различными, с помощью логарифмического рангового теста.

Результаты

Рисунок 1. Скрининг на модификаторы начала меланомы с помощью анализа miniCoopR. А) Схема анализа miniCoopR. Эмбрион со спасенными меланоцитами (стреловидный наконечник), содержащий вектор miniCoopR и интересующий ген. Масштабная линейка = 250 μM. Взрослая особь с более чем 4 мм² спасением меланоцитов (стреловидный наконечник). Масштабная линейка = 500 мкМ B)

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шлюзовые рекомбинационные реагенты	Инвитроген
miniCoopR
Антитела к митфе
FITC козье антитело IgG к кроликам	Инвитроген
Вектащит	Векторные лаборатории	Н-1000
Данио-рерио
701N 10 μл Шприц	Гамильтон/Фишер	Телефонный номер: 14-824
Фильтр 40 мкМ	BD Сокол/Фишер	352340 (Английский
ФБС	Инвитроген	26140079

)