Окрашивание меланоцитов чешуи антителами: метод обнаружения транскрипционных факторов, экспрессируемых в дорсальных чешуйчатых меланоцитах моделей рыбок данио

Аннотация

Источник: Шаранья Айенгар и др. Скрининг модификаторов меланомы с использованием модели автохтонной опухоли данио-рерио. J. Vis. Exp. (2012)

Это видео описывает метод окрашивания антителами для обнаружения экспрессии факторов транскрипции в меланоцитах, связанных с дорсальной чешуей, моделей рыбок данио. Этот метод иммуноокрашивания помогает конкретно идентифицировать меланоцит-индуцирующий трансфекционный фактор-А у трансгенных рыбок данио

.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Окрашивание антителами чешуйчатых меланоцитов

1. Составьте буфер PO₄ с 80 мл 0,1M Na₂HPO₄ и 20 мл 0,1M₂PO₄. Убедитесь, что pH равен 7,3. Составьте 2x фикс-буфер, содержащий 8,0 г сахарозы, 0,15 мл 0,2М CaCl₂ и 90 мл 0,2М буфера PO₄, pH 7,3. При необходимости отрегулируйте pH до 7,3 с помощью NaOH или HCl, затем сделайте до 100 мл с помощью буфера PO₄.
2. Весом до 300 мг твердого PFA и добавить в микроцентрифужную пробирку. Добавьте 5 мМ NaOH к объему, равному 4,5 x массе в мг PFA (например, 450 мкл 5 мМ NaOH до 100 мг PFA). Нагрейте до 60-70 °C с периодическим встряхиванием до тех пор, пока PFA не растворится. Уменьшите оставшиеся частицы и восстановите 20% надосадочной жидкости PFA. Каждый раз делайте его свежим.
3. Приготовьте фиксирующий раствор, содержащий 1x фиксирующий буфер и 4% PFA.
4. Обезболите рыб в дозе 0,17 мг/мл трикаина.
5. Используя падающий свет под препарирующим микроскопом, выщипывайте дорсальные чешуйки с помощью острых щипцов с тонкими наконечниками, стараясь не повредить половину чешуи, содержащую меланоциты (рис. 1A). Поместите чешуйки непосредственно из щипцов в 1 мл фиксирующего раствора и инкубируйте при комнатной температуре, переворачивая, в течение ≥ 2 часов. Пересадите рыбу в рыбную воду и следите за ней, чтобы подтвердить успешное выздоровление.
6. Для отбеливания пигментированных меланоцитов необходимо промыть неподвижные чешуйки в PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 раза в течение 5 минут при комнатной температуре. Добавьте 1 мл свежеприготовленного раствора отбеливателя, содержащего 0,4 мл 10% KOH и 0,15 мл 30% H₂O₂ в 5 мл с dH₂O. Наденьте парапленку или колпачки для предотвращения разрыва трубок газом. Продолжайте отбеливание, пока пигмент не исчезнет (обычно 10 минут) (Рисунок 1B, C). Постирать в PBST четыре раза в течение 5 минут при комнатной температуре.
7. Блокируйте в течение не менее 30 минут в блочном растворе, состоящем из 1x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 мг/мл BSA, 1% DMSO, 0,02% NaN₃ и 2% сыворотки ягненка. Исключите NaN₃, если развивается с реакцией HRP.
8. Инкубировать с первичным антителом в блочном растворе в течение ночи при комнатной температуре. На образцы должно быть не менее 400 мкл раствора, чтобы они оставались погруженными.
9. Промойте чешую 3 раза в течение 30 мин в PBST при комнатной температуре.
10. Инкубировать с вторичными антителами от 2 ч до ночи в блочном растворе комнатной температуры.
11. Окрашивать в течение 10 мин PBST + 0,1 мкМ DAPI.
12. Умыть 3 раза в течение 5 минут с PBST.
13. Установите весы на предметное стекло в каплю vectashield так, чтобы вогнутая сторона весов была обращена вниз к предметному стеколу, и наденьте на них стеклянную крышку. Заклейте края предметного стекла прозрачным лаком для ногтей и понаблюдайте за предметными стеклами под флуоресцентным микроскопом (рисунок 1D, E, F, G).

Результаты

Рисунок 1. Окрашивание меланоцитов чешуи антителами. А) Выщипывание чешуи у рыбки данио, находящейся под наркозом, miniCoopR-EGFP. Б) Неотбеленная чешуйка с пигментированными меланоцитами и В) Обесцвеченная чешуйка от данио-рерио miniCoopR-EGFP. Масштабная линейка = 100 μM. Неотбеленная чешуя, окрашенная антителом D)

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шлюзовые рекомбинационные реагенты	Инвитроген
miniCoopR
Антитела к митфе
FITC козье антитело IgG к кроликам	Инвитроген
Вектащит	Векторные лаборатории	Н-1000
Данио-рерио
701N 10 μл Шприц	Гамильтон/Фишер	Телефонный номер: 14-824
ФБС	Инвитроген	26140079