Анализ подкожной трансплантации: метод трансплантации клеток меланомы от донора к модели реципиентной рыбки данио-рерио

Аннотация

Источник: Iyengar, S. et al. Скрининг модификаторов меланомы с использованием модели автохтонной опухоли данио-рерио. J. Vis. Exp.(2012)

Это видео описывает метод трансплантации опухолевых клеток от модели донора данио-рерио, несущей меланому, реципиенту с ослабленным иммунитетом рыбке данио-рерио Casper. Это помогает визуализировать приживление и пролиферацию опухоли у рыбы-реципиента.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Анализ на трансплантацию

1. Подготовьте реципиентную рыбу Каспер в возрасте 2-3 месяцев путем облучения гамма-излучением 25 Гр за сутки до трансплантации. Дайте рыбе восстановиться в рыбной воде.
2. Усыпьте рыбу, несущую опухоль, в соответствии с рекомендациями учреждения. В частности, рыбу помещают в чашку с 0,6 мг/мл трикаина до тех пор, пока жаберные движения не прекратятся.
3. Отрежьте опухоль и поместите ее в чашку Петри с фильтром объемом около 5 мл, стерилизованным 0,9x PBS с 5% FBS. Нарежьте опухоль бритвой, находясь в растворе.
4. Работая при комнатной температуре, растирайте с помощью пипетки P1000, чтобы получить отдельные клетки. Восполните объем до 25 мл с помощью фильтра, стерилизованного 0,9x PBS с 5% FBS.
5. Фильтруйте через сетчатый фильтр 40 μM.
6. Вращайте в настольной центрифуге Eppendorf 5810R со скоростью 1 500 об/мин (453 rcf) в течение 10 минут.
7. Удалите надосадочную жидкость и доведите клеточную суспензию до примерно нужной концентрации (предположим, что на опухоль размером 100^мм3 приходится 10 7 клеток).
8. Рассчитайте точное количество клеток с помощью гемоцитометра и разбавьте клеточную суспензию так, чтобы конечный объем инъекции составил примерно 5 мкл. Например, если необходимо ввести 50 000 клеток, клеточную суспензию следует разбавить до конечной концентрации 10 000 клеток/мкл. Каждые несколько минут прокручивайте пробирку, содержащую клеточную суспензию, чтобы предотвратить слипание клеток.
9. Промойте калибр 26s (кончик со скосом) 701 N 10 мкл Hamilton 2-3 раза со 100% этанолом и 0,9x PBS. Загрузите в шприц 5 мкл клеточной суспензии.
10. Обезболите облученную рыбу-реципиента в дозе 0,17 мг/мл трикаина. Положите рыбу на бок на влажную кимвайп (рисунок 1А).
11. Стабилизируйте рыбу одной рукой и вставьте иглу скосом вверх под углом 45° в бок рыбы над брюшной полостью, примерно на полпути между задней границей заднего мозга и передней границей спинного плавника. Осторожно нажмите на поршень (Рисунок 1B).
12. Дайте рыбе восстановиться в пресной рыбной воде и ежедневно наблюдайте за ней на предмет приживления опухоли (рисунок 1C). Если приживление произошло, также может наблюдаться дальнейший рост и развитие болезни.

Результаты

Рисунок 1. Трансплантация клеток меланомы. А) Неинъекционная рыбка данио Каспер. Масштабная линейка = 500 мкМ. Б) Место подкожной трансплантации (стрелка) на облученного реципиента Каспера сразу после инъекции 50 000 клеток меланомы. Масштабная линейка = 200 μM. C) Облученный реципиент Casper, показывающий ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шлюзовые рекомбинационные реагенты	Инвитроген
miniCoopR
Данио-рерио
701N 10 μл Шприц	Гамильтон/Фишер	Телефонный номер: 14-824
Фильтр 40 мкМ	BD Сокол/Фишер	352340 (Английский
ФБС	Инвитроген	26140079

)