$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Приготовление сред и реагентов
- Приготовление 200-кратного запаса L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата
- Растворите 29 мг L-аскорбиновой кислоты-2-фосфата на 5 мл раствора модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) и профильтруйте через мембранный фильтр 0,22 мкм. Хранить в виде 0,25 мл стерильных аликвот при -20 °C.
- Добавьте 0,25 мл аликвоты 200x L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата в каждые 50 мл фибробластной среды (DMEM с 1% L-глутамина и 10% фетальной бычьей сыворотки) в требуемый день, чтобы конечная концентрация составила 0,1 мМ L-аскорбиновой кислоты-2-фосфата.
- Приготовление питательной среды для кератиноцитов
- Выделение и культивирование кератиноцитов первичного плоскоклеточного рака (ПКК) были описаны ранее. В ней также описано приготовление питательных сред кератиноцитов.
- Вкратце, подготовьте носители следующим образом:
300 мл DMEM и 100 мл Ham's F-12 с добавлением 10% FBS
0,4 мг/мл гидрокортизона
5 мг/мл инсулина
10 нг/мл EGF
5 мг/мл трансферрина
8,4 нг/мл холерного токсина
13 нг/мл лиотиронина
1х раствор пенициллин-стрептомицина
2. Построение in vitro нативного матрикса, полученного из фибробластов, в среде, дополненной L-аскорбиновой кислотой 2-фосфата
- Затравите 200 000 фибробластов в лунку в 6-луночные планшеты (20 000 клеток/см2) в среду фибробластов с добавлением L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата. Подкармливайте каждые 2-3 дня 2-5 мл среды. (Примечание: частота и объем повторной подачи могут быть отрегулированы в соответствии с индивидуальными потребностями различных клеток.)
- Толстый слой клеток, встроенный во внеклеточный матрикс, образуется в конце 6 недель, видимый невооруженным глазом (рис. 1). Чтобы снять этот слой с планшета для культуры тканей, осторожно соскребите окружность матрицы наконечником микропипетки объемом 1 мл, а затем сдвиньте края матрицы к центру лунки. Этот слой ячеек и матрицы (нативная матрица) должен быть легко отделяемым от поверхности пластины, и теперь плавать в среде. Разложите нативную матрицу на носителе, чтобы она не сворачивалась сама на себя.
- Дайте родной матрице поплавать и переделать ее в течение 5 дней, меняя среду каждые 2-3 дня. Из-за прочности на растяжение и внутреннего ремоделирования внутри матрицы матрица будет резко сжиматься и превращаться в меньшую, но более толстую нативную матрицу, готовую к использованию для инвазионного анализа.
3. Анализ на инвазию с опухолевыми кератиноцитами ПКК
- Аккуратно поднимите родную матрицу тупыми щипцами и переложите на нейлоновую сетку. Оказавшись на нейлоновой сетке, аккуратно раздвиньте матрицу, чтобы она лежала как можно ровнее, используя наконечник микропипетки объемом 1 мл и тупые щипцы.
- Подготовьте стерильные клональные цилиндры, смазав небольшое количество стерильного вазелина с одного конца.
- Поместите клональные цилиндры на родную матрицу вазелиновой стороной вниз. Это необходимо для обеспечения плотного прилегания между нативной матрицей и клональными кольцами.
- Добавьте клетки cSCC в клональные цилиндры (250 000 клеток в 100 μл питательной среды кератиноцитов).
- Удалите клональные цилиндры через 6 часов, когда клетки cSCC присягнут на нативном матриксе.
- Поднимите нейлоновую сетку с нативной матрицей и ячейками cSCC на границу раздела воздух-жидкость на изогнутую опору из проволочной сетки из нержавеющей стали.
- Добавляйте питательную среду кератиноцитов с добавлением аскорбиновой кислоты до тех пор, пока уровень среды не коснется дна нативного матрикса.
- Меняйте среды каждые 2-3 дня и собирайте урожай через 7 и 14 дней, после посева клеток cSCC.
