В этой статье мы подробно протокол для измерения кальпаин деятельность в фиксированных и живых клеток методом проточной цитометрии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение кальпаин деятельности в фиксированных и живых клеток методом проточной цитометрии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кальпаинов повсеместно внутриклеточный кальций-чувствительным, нейтральных протеаз цистеина
Протокол
Подготовка реагентов
Примечание: Все PBS содержит Са 2 + и Mg 2 +
- Обнаружение реагент
Добавить 20 мкм 7-амино-4-хлорметил кумарин, т-ВОС-лейцин-метионин амид (ВОС-LM-КЦР) до комнатной температуры PBS. Каждая ячейка подвески потребует 2 мл реагента обнаружения. - 1% Параформальдегид (Fixed клеток)
Развести 4% раствора параформальдегида акции при комнатной температуре PBS. Алиготе 1 мл 1% параформальдегида в каждую пробирку СУИМ. Три FACS труб, необходимых для каждого экспериментальных условиях (например, 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 понадобится 9 FACS труб) - PD15060....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Деятельности кальпаин в фиксированных и живых клеток 32Dkit была определена в этом видео протокол. Лечение линию клеток с ингибитором кальпаин PD150606 привело к полному торможению кальпаин активности в клетках. Кроме того, лечение ингибиторами MEK1 PD98059 привело к полному торможению кальпаин активности в клетках. ERK является основным активатором кальпаин-2 3. Эти результаты показывают, что кальпаин-2 активности преобладает в 32Dkit клеток. Текущая работа в нашей лаборатории изучает последствия повышения а.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Поддержке грантов от канадского института исследований в области здравоохранения, лейкемии и лимфомы общества Канады и лимфомы Фонд Канады.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ФСБ (PBS) BOC-LM-CMAC 4% параформальдегид | Invitrogen | Растворите 4 г параформальдегида в 100 мл PBS. В вытяжном шкафу нагревайте образец при перемешивании до полного растворения. Дайте остыть, затем храните при 4°C°C | |
| PD150606 | Invitrogen | Для максимального ингибирования кальпаина используйте свежеприготовленный раствор PD150606. | |
| PD98059 | Cell Signaling Technology | ||
| Пробирки для FACS с AlignFlow и AlignFlow plus флуоресцентными микросферами | Invitrogen | ||
| LSR II | BD Biosciences | В данных экспериментах в качестве источника IL-3 используется супернатант клеток WEHI-3. Каждая порция собранного супернатанта WEHI-3 титруется для определения оптимальной концентрации, необходимой для роста клеток 32Dkit. |
Ссылки
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
