$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Сделайте стекло иглы перед мыши хирургии:
- Положите капиллярной стеклянной трубки в съемник микропипетки.
- Тепло середине стеклянной трубки, чтобы смягчить стеклянной трубки в локализованной области.
- Стретч стеклянную трубку вдоль его продольной оси на начальное расстояние достаточно, чтобы вызвать сокращение диаметр стеклянной трубки в локализованной области.
- Держите растяжку стеклянную трубку, пока его разрыва. Таким образом, два одинаковых одной иглы баррель получаются.
- Положите стекло иголку в microforge. Углом 30 ° достаточно конических наконечника.
- Проверьте под микроскопом, что каждая игла имеет правильный внутреннего диаметра. Для большинства из гидрофильных препаратов 30-50 мкм, внутренний диаметр идеально (рис. 1).
- Заполнение иглы с минеральным маслом из самого широкого конца стеклянной иглы. Пусть это минеральное масло (MSDS, кат. M7700) входит по капиллярности, пока не достигнет ~ 50% от длины капилляра. Положите высоковакуумной смазкой (Dow Corning, Кат. 05054-AB) вокруг плунжера для герметизации широкого конце иглы.
- Вставьте поршень на широкий конец иглы и нажмите мягко минеральное масло, пока маленькая капля масла видел выход из кончик стеклянной иглы.
- Безопасные стеклянные иглу в держатель microinjector.
- Обезболить мышь с 2,5% Avertin (2,2,2-tribromoethanol + трет-амиловый спирт, 1:1 в / о). DOSIS 25-30μL на грамм внутрибрюшинно.
- Положите нагреватель накладка на стереотаксической устройство держать температуру тела животного при температуре 37 ° C.
- Место и безопасный мыши головой в стереотаксической устройства с помощью уха баров и зубы держателя.
- Чистая мыши головой с 0,1% раствором хлоргексидина глюконата, а затем на 70% этанола и 0,1% хлоргексидина глюконата для второй раз.
- Надрезать кожу хирургические лезвия № 15 от мыши уши, чтобы линия черепа Ламба.
- Польские черепа с хлопком своп для сухой его и вытащить из кожи операционного поля.
- Используйте кончик стеклянной иглы в точку в вершине шва брегмы. Там вы должны установить начальное положение инжектора (координата "ноль").
- Выберите точку для бурения путем перемещения "X" и "Y" оси стереотаксической устройства через череп.
- Дрель очень тщательно отверстия в выбранных координат. Microdrills и другим металлическим инструментом, ранее стерилизуют при 250 ° С в течение 60 секунд и сухих стеклянных бус стерилизатор (Cole Palmer, Кат. EW-10779-00).
- С тонкой пинцетом осторожно удалить глубокий слой кости и разрыв duramatter мембраны (вы увидите некоторые спинномозговую жидкость утечки).
- Убедитесь, что игла может пройти через просверленные отверстия.
- Внесите 1 мкл препарат нужно вводить и положил его на маленький кусочек парафильмом.
- Положите парафильмом на черепе.
- Соси в состав препарата, крутя колесо microinjector, в то время как вы проверяете под микроскопом, что жидкость идет вверх в стеклянную иглу.
- Удалить парафильмом и повторно установить нулевую координату.
- Перемещение иглы выбраны координаты, вплоть до держателя кончик стеклянной иглы осторожно прикасаться к поверхности мозга и установить "Z" координат в нуле.
- Ввести иглу в стекло паренхимы мозга на выбранной глубине.
- Вводите препарат медленно со скоростью ~ 1 п / с.
- При желании объем вводят, не говоря наркотиков диффундировать в паренхиму в течение 2 мин. Затем переходите к удалить иглу плавно и медленно.
- Клей хирургических ран и снять животное от стереотаксической устройства и положил животное в подогретого клетку содержащую чистую постель для наркоза.
- Для обеспечения послеоперационного обезболивания все животные получали 5 мг / кг подкожного Кеторолак каждые 12 часа в течение 24 ч.
Представитель Результаты:
Когда после этого протокола, очень точный впрыск получается и очень узкие иглы трек сводит к минимуму повреждения мозга. Как представитель результате этого метода, мы вводили lysophosphatidyl холин (лизолецитин) в мозолистое тело, которое производит демиелинизации белого путей дело 1-4. Чтобы свести к минимуму травмы головного мозга производства стеклянной иглы, мы вводили только 20 п о лизолецитина в мозолистого тела, а при необходимости увеличения объемов до 200 п может быть введен с тем же методом. Демиелинизации обнаруживается отсутствие миелина основных экспрессии белка в белом участки материи (рис. 2).
Рисунок 1. Стеклянной иглы с 50-мкм в диаметре. Расстояние между двумя короткими клещейв масштабе представляет собой 50-мкм длиной.
Рисунок 2. Лизолецитина инъекций в мозолистое тело. Демиелинизации показан как не миелина основных экспрессии белка (пунктирная область). Обратите внимание на небольшие размеры стеклянных иглу-кишечного тракта (стрелки). Бар = 100 мкм