Этот протокол используется выпадающее анализ, чтобы определить уровень активной RhoC ГТФ внутри клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
RhoC GTPase Активация Пробирной
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
RhoC GTPase имеет 91% гомологию с RhoA ГТФ. Из-за своей распространенности в клетках, многие реактивы и методики RhoA GTPase были разработаны. Тем не менее, RhoC GTPase выражается в метастатические раковые клетки при относительно низких уровнях. Таким образом, несколько RhoC-специфических реагентов были разработаны. Мы адаптировали анализа Rho активации для обнаружения RhoC ГТФ. Эта техника использует GST-связывающий белок Rho слияние домена вытащить активных GTPase RhoC. Кроме того, мы можем урожай общего белка в начале анализа для определения уровня общего (ГТФ и ВВП граница) RhoC ГТФ. Это позволяет для определения активной по сравнению с общим RhoC ГТФ в клетке. Несколько коммерческих версий этой процедуры были разработаны однако, коммерческие наборы, оптимизированные для RhoA ГТФ и, как правило, не работают хорошо для RhoC ГТФ. Части анализа были изменены, а также развитие RhoC-специфических антител.
Протокол
1. Подготовка GST-синтез белка
- Глицерин запасы JM109 компетентных бактерий содержащий первые N-терминал 90 аминокислот rhotekin Rho связывающий домен (РосБР) субклонировали BamH1/EcoR1 pGEX3x вектора сделаны.
Чтобы убедиться в высокой эффективности следующие шаги должны быть выполнены для каждого эксперимента. По нашему опыту, свежеприготовленный GST-РосБР имеет ключевое значение для надежного и точного анализа активации ГТФ. - Добавить 50 мкл (приблизительно, не оттепель) глицерина акции до 50 мл LB усилителя и расти 37 ° С в течение ночи при встряхивании.
- Развести 1:10 в 500 мл LB-усилителя и растут в течение 1 ч.
- Выз....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наиболее критичным этапом процедуры является генерация свежих GST-РосБР. Невыполнение обратить пристальное внимание на этот шаг является основной причиной для отказа. Все шаги, от поколения GST-RBD (1.2) для инкубации в течение ночи с Клеточный лизат (2,5), должно быть сделано в течение одного дня. Еще один важный шаг, чтобы убедиться, что Есть достаточное количество клеток для получения клеточных лизатов. Это имеет особое значение при взгляде на RhoC ГТФ, который, как правило, присутствуют в низком уровне в клетке.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Кафедра обороны W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 и W81XWH-08-1-0356
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Сорбиент Glutathione-sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| Гели Criterion 4-20% Tris-HCl | Bio-Rad | 345-0032 |
Ссылки
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
