Organoptypic гиппокампа модель культуры срез В пробирке Модели используются для изучения нейронных травмы в различных парадигм. В этой статье мы опишем методы генерации срез культуры и количественной нейронов травмы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Органотипической гиппокампа Модель культуры фрагмент за рассмотрение нейронов травмы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Органотипической гиппокампа культуры срез в пробирке метод для изучения механизмов нейронных травмы, в которой базовая архитектура и состав гиппокампа является относительно сохранившихся 1. Органотипической системе культуры позволяет изучение нейронов, астроцитов и микроглии эффекты, но, как бывший подготовки естественных условиях, не рассматриваются последствия кровоток, или вербовки периферических воспалительных клеток. С этой целью, эта культура метод часто используется для изучения excitotoxic и гипоксических повреждений пирамидных нейронов гиппокампа, а также используется для изучения воспалительной реакции. Здесь мы опишем методы генерации гиппокампа культур ломтик от послеродовой мозга грызуна, управления токсичными стимулы, чтобы побудить нейронов травмы, и опробование и количественной гибель нейронов гиппокампа.
Протокол
1. Подготовка
Прежде чем начать, собрать необходимые хирургические инструменты, рассечение и питательных сред, а также на 7 дней старая крыса или мышь щенков. Протокол является одинаковым для мышей и крыс препаратов.
(Я) Материалы и оборудование
- Операционная ножницы (прямая длина 6 ", кот # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
- Micro рассекает ножницы, (длина 4 '", кошка # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
- Углеродистая сталь Дюмон Пинцет (кошка # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
- Измененный стекло "передачи" пипетки (низ пипетки Пастера удалены и сглаженные края)
- Aclar пластиковой пленки сократить до 2 "в х 2" на площадях (Honeywell, # 812071, Потсвилл, PA)
- Обложка губки 4, по 3 в (Кендалл, кошка # 3157, Мэнсфилд, штат Массачусетс)
- 30 мм мембраны Millicell вставками (0,4 мкм, Millipore, Bedford, MA)
- Mcllwain тканей вертолет с обоюдоострым лезвием бритвы (McILwain ткани измельчитель, Vibratome компании, Сент-Луис, Миссури)
- Инвертированный микроскоп с ПЗС-камера и программное обеспечение для анализа изображений
(II) Препарирование Средний (DM, 1 л при рН 7,3)
| Сбалансированный Хэнка Соль | 1 флакон (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) |
| NHCO 3 (4,2 мм) | 350 мг |
| HEPES (10 мМ) | 2,83 г |
| Глюкоза (33,3 мм) | 6,0 г |
| Пенициллин / стрептомицин (100x) | 10 мл |
| BSA (0,3%) | 300 мг |
| MgSO 4-7H 2 O | 1,44 г |
(III) Культура средой (400 мл)
| MEM (Invitrogen 11575-032) | 200 мл |
| *** Баланс Хэнка Соль (Invitrogen 24020-117) | 100 мл |
| Лошадиной сыворотки (Invitrogen 26050-070) | 100 мл |
| HEPES буфера (1 М; Invitrogen 15630-080) | 5 мл |
| Пенициллин / стрептомицин (100x) | 4 мл |
| *** Добавить 12,8 г глюкозы в солевой баланс 500 мл Хэнка до принятия культуральной среде | |
(IV) Животные
На 7 дней старая крыса или мышь послеродовой щенков, как правило, один помет в эксперименте.
2. В День культуры
- Все рассечение инструментов и Aclar пленка должна быть промыты в 70% этаноле в течение 30 минут до начала. Поверхности вскрытия капота, лезвия, и ткани вертолета должны быть продезинфицированы с этанолом.
- Подготовка нескольких (3-4) 6 луночных культуры ткани, добавить 1 мл культуральной среды на лунку, и вставьте Millipore мембрана в каждую лунку. Место 6-луночных планшетах в 37 ° инкубаторе до готовности передать ломтиками.
- Подготовка нескольких (4-6) 60 мм пластин с СД и место на льду.
- Быстро обезглавить с ножницами и падение в 70% этанола, и быстро выставить мозга с сагиттальной разрез черепа. Осторожно снимите мозга и сразу же в холодную DM. Отдельные его на два полушария и место каждого полушария медиальной стороной вниз на крышку губкой в течение 2-3 секунд.
- Аккуратно поднимите и место полушарии на Aclar квадратных фильма и место на ткани вертолет; вырезать мозг коронки в 350 мкм разделов. Когда закончите, осторожно извлечь квадратный Alcar с секционным полушарии и погрузить в холодную DM.
- Использование рассекает микроскоп, выделить гиппокампа разделов. Для крыс, не должно быть 5 разделов охватывающих ростральнее хвостового гиппокампа, а также для мыши не должно быть 3-4 секций.
- Выньте 6-луночных с мембраной вставками из 37 ° культуре ткани инкубатора. Передача срезах гиппокампа индивидуально на мембраны использованием пипетки стеклянные передачи. Если слишком много немецких марок выпускается на мембране, удалить излишки ДМ с пипетки Пастера. Место пять срезах гиппокампа на каждой мембраны. Позвольте по крайней мере 3 скважин в состояние, или 15 ломтиков.
- Инкубируйте культуру пластин при 37 ° в 5% CO увлажненный инкубаторе в течение 12-14 дней до начала токсичности эксперимента. Культуральной среде может быть изменен дважды в неделю.
3. Стимулирование и Количественная гиппокампа нейронов травмы в фрагмент культуры
- После 12-14 дней в области культуры, добавьте 5 мкг / мл пропидий йодида (PI) в культуральной среде. Этот шаг позволит визуализации и количественной оценки базальной клеточной смерти.
- На следующий день, количественно PIфлуоресценции в субрегионе СА1 (и / или СА3 или зубчатые по желанию) каждого среза гиппокампа и получить среднее PI флуоресцентных измерений представляют базальной клеточной смерти (именуемые время = 0 часов, или T 0). Для получения изображения и количественное, мы используем OpenLab программное обеспечение (Импровизация, Великобритания), но и другие приобретения и анализа изображений программное обеспечение может быть использовано для количественной интенсивности флуоресценции.
- Сразу же после захвата изображений из T 0 PI флуоресценции, вызвать повреждение нейронов вашим методом выбора (мы воспользовались 10 мкМ NMDA-, кислород-глюкозы лишения или LPS в течение одного часа, чтобы вызвать нейронов токсичности 2,5). После токсичных стимул, заменить средний свежей средой, содержащей 5 мкг / мл PI и поддерживать ломтиками ночь.
- На 3-й день, количественно означает П. И. флуоресценции экспериментальных условиях на 24 часа, или Т-24.
- После этого захвата изображений, немедленно изменить средних и добавить 10 мкМ NMDA и 5 мкг / мл PI и инкубировать ломтиками ночь, чтобы добиться максимальной гибели нейронов.
- На 4-й день, количественно означает П. И. флуоресценции максимальная гибель нейронов, определяемая как Т макс. Рассчитать смерти процентов ячейки следующим образом: (Т 24 - Т 0) / (Т макс-T 0).
4. Представитель Результаты
Рисунок 1. () Время линия для производства гиппокампа и последующей экспериментальной травмы и получения изображений. (B), представитель образы срезах гиппокампа у основания (T 0), 24 часов после 1 часа воздействия 10 мкМ NMDA (Т 24), а еще через 24 часа или 10 мкМ NMDA для получения максимального нейронов травмы (Т макс).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Есть два важных момента, чтобы следовать, чтобы обеспечить воспроизводимость и устойчивые результаты при репликации экспериментов. Во-первых, важно, чтобы гиппокампа возрасте ломтиками по 12-14 дней до начала эксперимента. С ломтиком изоляции, существует значительная микроглии ответ, и микроглии оставаться включенным в течение некоторого времени, с возвращением к отдыхает разветвленной состояние, наступающее на 10-й день в пробирке 3,6. Во-вторых, средняя П. И. интенсивность флуоресценции пропорциона...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Финансируемая NINDS, Американской ассоциации сердца, Американской федерации исследований старения, март Dimes
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Ссылки
- Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).
- McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia. J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).
- Czapiga, M., Colton, C. A. Function of microglia in organotypic slice cultures. J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).
- Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures. J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).
- Wu, L., Wang, Q., Liang, X. Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival. Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18, 319-319 (1996).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
