Корона области различных петли V3 последовательности гликопротеина поверхности оболочки (gp120) ВИЧ-1 может быть структурно характеризуется во многих случаях в кремнии складывания позиции 10 по 22 цикле, используя состоянии современных Неэмпирических Складной алгоритма. Здесь мы показываем, складные и оценки этой области петли V3 от R2 штамма ВИЧ-1, однозначно нейтрализации чувствительного штамма с загадочным функциональными свойствами.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка Иммунологически Соответствующие Динамическая третичный Структурные особенности ВИЧ-1 петли V3 Последовательность R2 короны на Неэмпирических Складные
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Антигенного разнообразия ВИЧ-1 уже давно препятствием для вакцины дизайн, и эта изменчивость особенно проявляется в цикле V3 поверхностных гликопротеинов конверт вируса. Ранее мы предложили корону петля V3, хотя динамичной и последовательность переменной, ограничивается для всего населения ВИЧ-1, вирусов на иммунологически соответствующих β-шпильки третичной структуры. Важно отметить, что Существуют тысячи различных последовательностей петля V3 корону в циркулирующих ВИЧ-1, вирусов, что делает 3D-структурные характеристики тенденции в разнообразие вирусов трудно или невозможно по кристаллографии или ЯМР. Наши предыдущие успешные исследования с переносом V3 корона 1, 2, используемый алгоритм неэмпирических 3 доступны в ICM-Pro молекулярной пакет программного обеспечения для моделирования (Molsoft LLC, Ла-Хойя, Калифорния) и предложил корону петли V3, в частности, от должности от 10 до 22, льгот достаточно от гибкости и длина его стеблей фланговые вести себя в значительной степени, как если бы это было неограниченным пептид свободно складывающиеся в растворе. Таким образом, быстрое неэмпирического складывания только эта часть петли V3 любого человека штамм 60000 + циркулирующих ВИЧ-1 штаммы могут быть информативными. Здесь мы сложенном петли V3 R2 напрягаться, чтобы вникнуть в структурную основу его уникальные свойства. R2 медведи редкими последовательность петля V3 считается ответственным за изысканной чувствительности этого штамма к нейтрализации сывороток пациентов и моноклональных антител, 4, 5. Напряжение посредником CD4-независимых инфекции и, похоже, вызывают широко нейтрализующих антител. Мы показываем, как оценка результатов складывания может быть информативным для связывания наблюдаемые структуры в складной с иммунологическими деятельности наблюдается R2.
Протокол
1. Методология
- Первый шаг протокола, чтобы выбрать V3 последовательность корону вы желаете сдаться в кремнии. Для R2 напряжения, последовательность для этого фрагмента KSIPMGPGRAFYT.
- 3D атомной структуры пептид, соответствующий этой последовательности должен быть построен в виртуальное пространство компьютера. Команда ICM для этого:
buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
или Файл: Новое: пептид может быть выбран под выпадающим меню - Несколько параметров процедуры, затем установить, в том числе количество поисковых шагов (длина поиска), моделирование температуры, стратегию поиска параметров, включая переменную ограничений для смещения в направлении поиска разумных областях, энергетическом смысле, выбор различных методов расчета энергии, и параметры, указывающее, как поиск будет записан например, следует ли записать фильм и сколько промежуточных конформаций забив должны регистрироваться. Все эти параметры были оптимизированы предыдущих публикациях (см. www.molsoft.com).
- Складные затем начинать с команды:
Монте-Карло
или Файл: Новое: пептид может быть выбран под выпадающее меню молекулярной механики: Сведение к минимуму: Глобальная
В первом случае параметры, начиная с шага 3, должны быть установлены одна за другой в командной строке. В последнем случае, флажки для наиболее часто выбранных параметров приведены в панели, прежде чем команда. Для удобства, складной же сценарий ICM использовать для этого эксперимента и ранее опубликованные экспериментах показано здесь:
Этот сценарий может быть сохранен в текстовый файл и запустить от операционной системы компьютера командной строки (как правило, LINUX), быстро, используя команду:
ICM _foldingscript
2. Секреты успеха
- Петля V3 является постоянной 35 аминокислот в длину почти во всех известных напряжения, так положениях аминокислот пронумерованы от 1 до 35, начиная с происхождения дисульфидных связанных цистина на 1 и кончая соответствующий дисульфид связанных цистина в 35 лет. Так как она является частью цикла, границы корону V3 должны быть тщательно подобраны. Если слишком большой фрагмент был выбран, он вряд ли будет вести себя как гибкий сегмент свободно, как будто это свободный пептид, так складной моделирование не будет правильно оценить структуру. Если слишком маленький фрагмент выбран, информативным третичной структуры не могут образовывать в симуляции. Наше предварительное исследование показало, что фрагмент с позиции 10 до позиции 22 коррелировало с антителами связаны кристаллографические конформации, так что это фрагмент любой петли V3, которые должны быть выбраны для складывания.
- Хотя при использовании графический пользовательский интерфейс и выпадающие меню удобна для пользователя, до успешной работы на пептид складывающиеся в общем использовании ICM и петли V3 корону складной, в частности, использованы сценарии выше, просто изменив последовательность в линию и работает buildpep скрипт из командной строки рекомендуется.
3. Представитель Результаты
Результаты R2 складной представляющих результаты для любого петли V3. Для оценки результатов проекта файл (он будет называться "newProject1.icb" из приведенного выше сценария) должны быть открыты и "молекулярной механики, Stack View" выбрали. Таблица стек конформации появится. Стек конформации могут быть визуализированы графически, нажав на участок / Гистограмма значок. "Молекулярной механики, Stack, Play" будет снимать фильм о стеке визуально оценить конформационных предпочтений, обнаруженные складывания. Для R2 последовательности, конформации бета-шпильки-как, как ожидалось для V3 петли 2 - особенно в фрагменте в положениях от 12 до 14, где ясно β-цепи предпочтение увидеть во всем стеком, и очень немногие альфа-спиральной конформации не видно. Кроме того, энергетическая щель почти 3 единицы видна между самым низким конформации энергии и является вторым наименьшим энергии конформации. С энергетической точки зрения это означает, что структура только мерцает из наименьшей энергии конформации менее одного процента того времени: складной поэтому результаты позволяют предположить, что R2 V3 корона жесткой, а не гибкой, структура. Там могут быть дополнительные важные структурные особенности в ансамбле конформации, но их трудно систематически оценить.
| JRFL | SF162_V3JRFL | SF162_V3R2 | |
| 447-52D GMT 50 | 15 | 0,00061 | 0,00078 |
Таблица 1: относительная нейтрализация JRFL и R2 V3 петли в масках и разоблачен настройки. Данные были ранее сообщалось в Кардосо Т., и др.. ARHR (2008) и Пинтер, А., и. др. J. Virol (2004). Короче говоря, нейтрализующих активность определяли с помощью одного цикла инфекционности методом с использованием psVs генерируется с ENV-дефектных люциферазы, экспрессирующих pNL4-3.Luc.RE-плазмиды pseudotyped с JRFL Env или SF162 V3 вариантов, описанных выше: SF162_V3JRFL содержит JRFL петли V3 последовательность в месте SF162 последовательность петля V3. SF162_V3R2 содержит петлю R2 V3 последовательность в месте SF162 последовательность петля V3. PsVs инкубировали с серийных разведений 447-52D МКА в течение 1,5 ч при 37 ° С, а затем добавил к CD4 + + U87 CCR5 клетки-мишени покрытием в 96-луночных планшетах в присутствии polybrene (10 мг = мл). После 24 часов, клетки refed с RPMI среде, содержащей 10% FBS и 10 мг = polybrene мл, а затем дополнительные 24-48 ч инкубации. Люциферазы активность определяли 48-72 ч postinfection с люминометра планшет (Харта, Inc) с помощью анализа реагенты из Promega, Inc геометрические титры значит для 50% нейтрализации (GMT50) по 447-52D были определены путем интерполяции кривых и нейтрализации являются средними по крайней мере трех независимых анализов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
НЕЭМПИРИЧЕСКОЕ складной показывает третичного структурные свойства, последствия которых не может быть видно из изучения отдельных аминокислот последовательно. Несколько ранее неясных структурные свойства R2 петли V3 корону выявлены путем складывания моделирования. Эти наблюдаются структурные предпочтения могут коррелировать с наблюдаемыми функциональные свойства R2 напряжения, а именно чувствительность к нейтрализации и hyperinfectivity 5.
Во-первых, ясно β-цепи тенденция...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке грантов от Фонда Билла и Мелинды Гейтс (# 38631) и NIH, в том числе DP2 OD004631 и R01 AI084119.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ICM-Pro | Molsoft LLC |
Ссылки
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &, Cardozo, T. Dynamic characterization of the V3 loop crown. Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop. AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).
- Abagyan, R., Totrov, M. Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins. J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).
- Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response. AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).
- Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response. J Virol. 76, 644-655 (2002).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
