Ортотопическая Модель серозного рака яичников у иммунокомпетентных мышей для В естественных условиях Опухоль изображений и мониторинг иммунного ответа опухоли

Краткое содержание

Для изучения В естественных условиях Рост опухоли и микроокружения, мы использовали сингенных и ортотопической мышиной модели рака яичников у иммунокомпетентных животных. Мы трансдуцированных клетка опухоли мышей линии (MOV1) с Katushka флуоресцентный белок (MOV1 ^KAT), И здесь мы показываем свою ортотопической имплантации в яичнике и В естественных условиях Изображений.

Аннотация

Обоснование: Рак яичников обычно диагностируют на поздней стадии, когда соотношение заболеваемости и смертности велико, поэтому он остается самым летальным из всех гинекологических злокачественных новообразований среди женщин в США ^1,2,3. Серозные опухоли являются наиболее распространенными формами рака яичников ^4,5, и трансгенная линия Tg-MISIIR-TAg представляет собой единственную модель мышей, у которых спонтанно развиваются опухоли этого типа. Мыши Tg-MISIIR-TAg экспрессируют трансформирующий регион SV40 под контролем промотора гена рецептора II типа ингибирующего вещества мюллеровых протоков (MISIIR) ⁶. Были выявлены дополнительные трансгенные линии, которые экспрессируют трансген SV40 TAg, но у которых не развиваются опухоли яичников. Мыши, не склонные к образованию опухолей, имеют типичную для мышей C57Bl/6 продолжительность жизни и являются фертильными. Этих мышей можно использовать в качестве реципиентов сингенеичных аллографтов для опухолевых клеток, выделенных из мышей Tg-MISIIR-TAg-DR26.

Цель: Хотя визуализация опухолей возможна ⁷, раннее обнаружение глубоко расположенных опухолей у мелких живых животных представляет собой сложную задачу. Для проведения доклинических исследований на иммунологически интактной животной модели серозного рака яичников мы описываем сингенную мышиную модель этого типа рака яичников, которая позволяет проводить визуализацию in vivo, изучать микроокружение опухоли и иммунный ответ на опухоль.

Методы: Сначала мы выделили линию раковых клеток мыши TAg+ (MOV1) из спонтанной опухоли яичника, полученной от 26-недельной самки DR26 Tg-MISIIR-TAg. Затем мы провели стабильную трансдукцию клеток MOV1 с помощью млекопитающего лентивирусного вектора TurboFP635, кодирующего Katushka — дальне-красный мутант красного флуоресцентного белка актинии Entacmaea quadricolor с максимумами возбуждения/эмиссии 588/635 nm ^8,9,10. Мы провели ортотопическую имплантацию MOV1^Kat в яичник ^11,12,13,14 самок мышей Tg-MISIIR-TAg, не склонных к образованию опухолей. Прогрессирование опухоли отслеживали с помощью оптической визуализации in vivo, а микроокружение опухоли анализировали методом иммуногистохимии.

Результаты: Ортотопически имплантированные клетки MOV1^Kat развили серозные опухоли яичников. Опухоли MOV1^Kat можно было визуализировать с помощью визуализации in vivo в течение трех недель после имплантации (рис. 1); в них наблюдалась инфильтрация лейкоцитами, как это происходит при раке яичников у человека ¹⁵ (рис. 2).

Выводы: Мы описываем ортотопическую модель рака яичников, подходящую для визуализации ранних опухолей in vivo благодаря высокой pH-стабильности и фотостабильности Katushka в глубоких тканях. Мы предлагаем использовать эту новую сингенную модель серозного рака яичников для исследований методом визуализации in vivo, а также для мониторинга иммунного ответа опухоли и эффективности иммунотерапии.

Протокол

1. Культуре клеток

1. Перед ортотопической инъекции, культуры MOV1 ^Kat клетки, полученные из DR26 опухолей, в T175 колбу, пока они не 90% вырожденная. План использования от 1 до 5 миллионов клеток на инъекцию, для чего потребуется 1 или 2 T175 колб.
2. В день инъекции, урожай клеток и определить номер ячейки использованием гемоцитометра.
3. Как только концентрации клеток было определено, пеллет клетки центрифугированием в течение 5 минут при 300 Х г при комнатной температуре.
4. После спина, ресуспендируют клетки иметь 1 миллион в 10 мкл стерильной PBS с 0,002 М ЭДТА

2. Предварительно хирургии

1. До операции, пополнить 3/10cc шприц инсулина с 1 млн. ^MOV1-Кат клеток в 10 мкл PBS ЭДТА.
2. Передача isofluorane наркозом мыши грелку. Добавить глазную мазь, чтобы предотвратить обезвоживание глаз. Затем сразу же вставить голову животного в системе носового конуса связаны с изофлуран испарителя доставить анестезии всей операции.
3. После дезинфекции место инъекции спиртом тампоны, подкожно вводят 5 мг / кг Кетопрофен, предоперационная болеутоляющее, с 3/10cc шприц инсулина.
4. Использование кусачки, бриться левой хвостовой части спинки от грудопоясничного перехода к основанию хвоста животного. Нанесите крем удаления волос для полного удаления волос. Затем удалите излишки с мокрым бумажным полотенцем.
5. Как только волосы были удалены, стерилизовать бритой области с повидон-йодом и спиртом тампоны. Затем поместите хирургических драпировать вокруг области разреза.

3. Хирургия

1. Незадолго до операции, регулировать уровни изофлуран испаритель до 1,5%.
2. Убедитесь, что животное полностью под наркозом, зажимая ногу площадку.
3. Затем найдите селезенки под кожей. Затем, используя хирургические ножницы, чтобы дорсолатеральной разрез 1-2 см в длину на правой верхней части селезенки.
4. Рассеките забрюшинного пространства. Площадку окружающих мыши яичников будет наблюдаться. Использование изогнутых щипцов для восприятия и подвергать жировой ткани окружающие мыши яичника.
5. Гидратов орган с несколько капель стерильного PBS.
6. Использование изогнутых щипцов для понимания, убрать ... Позиция ... и затем закрепите яичников для инъекций
7. Решительно схватив яичника с щипцами, вводят 10 мкл MOV1 клетки ^Kat опухоли в яичниках. Твердое понимание позволит предотвратить срыгивание жидкости или утечки.
8. Сразу же после инъекции, снять напряжение со стороны щипцами. Перфорация в яичнике должно спонтанно отказаться и закрыть.
9. Использование рассасывающиеся нити кислота полигликолевой прилагается к игле, рядом ретро-брюшины раны.
10. Выпуск животного от носа конус.
11. Натяжные кожи и печатью дорсолатеральной краев раны с несколькими каплями клея ткани.
12. Наконец, устно управлять 100 мкл антибиотики для животных. Затем поместите его обратно в клетку и монитор для восстановления. Держите животное на антибиотики в питьевой воде в течение одной недели.

4. В естественных изображений

1. Через неделю после ортотопической инъекции MOV1 клетки ^Kat опухоль, выполняют в области обработки изображений естественных условиях. Начните с передачи isofluorane наркозом мыши изображения камеры.
2. Включите изофлуран уровня испарителя до 2%.
3. Выполните в естественных изображений в соответствии с инструкциями изготовителя изображения системы. В этом видео, системы Lumina будет использоваться.
4. Чтобы создать образ, нажмите живой образ программного обеспечения на рабочем столе. Затем, на панели управления Приобретение ИВИС, выберите "Initialize". Настройки прибора аналогичны настройки камеры
5. На панели управления приобретение создана приобретение инструмента параметров. Для флуоресценции, установите флажок "Лампа дневного света." Нажмите Фотография поле, чтобы приобрести фотографии с каждого изображения.
6. Далее, установите выдержку как Auto. В разделе "Pixel биннинга или CCD разрешение", установите флажок "Medium". Тогда в F / стоп или диафрагмы, проверьте значение 2. Далее, выберите фильтр 535 возбуждения и DsRed фильтра выбросов.
7. Под полем зрения, щелкните по View B имиджу одной мыши.
8. Затем нажмите на приобретение, чтобы начать захвата изображений.
9. После получения изображения завершена, использования области интереса, или ROI, инструмент для измерения сигнала. Нажмите на иконку для измерения выпуска значений сигнала и области.
10. Наконец, нажмите кнопку "Сохранить" для сохранения изображения в папке пользователя
11. После того, как изображения были сохранены, остановить администрации изофлуран и вернуть мышь в клетку. Мышь должна проснуться немедленно.

5. Представитель Результаты

-С помощью этого протокола, В естественных условиях роста из ортотопической рака яичников можно наблюдать в течение 3 недель, используя неинвазивные процедуры.

Рисунок 1. MOV1 ^Kat клеток, или PBS в качестве отрицательного контроля, были orthotopically вводят в яичнике неопухолевой склонны мыши (правая и левая животных и животных соответственно). В естественных изображений была выполнена через 2 недели. Флуоресценции выбросов, полученных от MOV1 клетки ^Kat привиты в яичнике было измерено и по сравнению с тем, от отрицательных управление мышью.

Рисунок 2. Замороженные разделы MOV1 опухолей яичников ^Kat окрашивали биотинилированного анти-CD4 мАт следуют DAB подложки (темно-коричневый) для обнаружения опухоли проникают лимфоциты (черная стрелка). Клетки контрастно с метил-зеленый для визуализации клеточных ядер (синий). Опухолевые клетки (красные стрелки) были морфологически отличие от Т-клеток. Слайд появляется увеличенное 40x.

Обсуждение

Хирургии и Ортотопическая инъекций

Ортотопическая инъекций в яичниках сумки требует подготовки и точности. Таким образом

1. В случае плохой хирургический опыт, практика с трупов в первую очередь.
2. Использование преимущественно повторнородящих женщин (один или два помета), как они развивают большую яичников в течение долгого времени, что облегчает введение и увеличение выживаемости для сравнения с нерожавших женщин.
3. Из-за небольшого размера сумки яичника мыши, испол...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM-GLUTAMAX	Invitrogen	10564-011
PBS	GIBCO, by Life Technologies	14040
Версен (Versene)	Lonza Inc.	17-711E
Грелка	Deltaphase	39 DP
Повидонсодержащие салфетки	Dynarex	1108
Спиртовые салфетки	Fisher Scientific	06-669-62
Мазь «Искусственные слезы»	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	17845-153
Кетопрофен	Fort Dodge Animal Health
Инсулиновый шприц 3 куб. см	BD Biosciences	309301
Шовный материал с иглой из полигликолевой кислоты (3/8 19 мм)	Syneture	9612-31
Тканевый клей	Vetbond	3M
Вет. Бактрим / суспензия для перорального применения	Hi-tech Pharmacal	840823
IVIS-Lumina	Caliper Life Sciences
Изофлуран	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	J108013
Фетальная бычья сыворотка, квалифицированная	Invitrogen	10437036
Пенициллин/стрептомицин	GIBCO, by Life Technologies	15140
Млекопитающий вектор TurboFP635	Evrogen	FP721
Флаконы T175	cellstar	660-190