$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Индукция и мониторинга хронического рецидивирующего-EAE
Эмульсия смеси 1:1 антигена в водный раствор добавляется дополнен полного адъюванта Фрейнда. Это очень важно, чтобы добавить антигена адъювантной а не наоборот!
Существует большое количество отходов при принятии и потребителей инъекционных эмульсии. Всегда готовьте 1,5 или 2 раза больше, чем то, что вам нужно.
Используйте автоклаве раствором, пестик, стеклянные шприцы, и мосты. Все пластики должны быть стерильными. Препарат может быть сделано на регулярной лабораторном столе.
1. Подготовка дополнен адъювантной
Взвесьте 30 мг микобактерий туберкулеза (Difco каталога # 231141) и поместите в раствор. Убедитесь в тонкий порошок, не нажимая слишком сильно, чтобы избежать нарушения бактерий. Добавьте 10 мл Фрейнда адъювантной H37Ra (Difco каталога # 231131) и перемешать. Это дополнено адъювантной теперь содержит 4 мг / мл микобактерий туберкулеза. Трансфер в трубке.
2. Подготовка спинного гомогената шнур
Сбор спинной мозг от Д. А. крыс (возраст / пол равнодушным) и хранить замороженными при температуре -80 ° C. Взвесьте замороженное спинной мозг, чтобы иметь достаточно смешать 1:1 (вес: объем) с дополнены адъюванта. Фарш спинной мозг так хорошо, как возможно с лезвием, трансфер в раствор, использованный в разделе 1, и сделать пасту с пестиком.
3. Подготовка эмульсии
- Место дополнен полный адъювант Фрейнда в трубке. Vortex на высокой скорости. Добавить спинного мозга гомогената по капле в то время как вортексе. Когда все спинного гомогената шнур добавил, вихревые еще 5 минут. Смесь следует обратиться светло-розовый.
- Положите эмульсии в 5 мл шприц стекла и связать его с еще 5 мл стеклянный шприц использованием моста 18G (Fisher Каталог № 14-825-17L). Отправить эмульсии из шприца в другой, пока не становится трудно (5-10 мин). Если более 5 мл эмульсии готовят, используя несколько шприцов 5 мл НЕ использовать большие шприцы.
- Эмульсии могут быть сохранены в шприцах при 4 ° С в течение 3 недель. Я рекомендую его подготовке не менее 12 часов заранее, чтобы убедиться, что она не ломаются. Она должна оставаться толстыми, а не отдельно в 2 этапа. Цвет будет меняться в ночь на светло-желтый или бежевый.
4. Иммунизация крыс
- Смешайте эмульсии в шприцы в течение нескольких минут и трансфер в шприц для инъекций. Inject 200 мкл подкожно у самого основания хвоста использовании игл 23G и 3 мл Луер-Лок шприцы по краткосрочным наркозом.
- Получатели 7-9 недель самок крыс DA. Мы получаем наш крыс от Харлан-Sprague Dawley.
- Крысы должны быть соблюдены два раза в день и весил в день. Клинические признаки, как ожидается 7-15 дней после введения эмульсии.
Клинические подсчета очков:
0: нет болезни
0.5: дистальной вялым хвостом
1: хромать хвост
2: умеренный парапарез, атаксия
3: умеренные парапарез, крыс поездки, время от времени
3.5: одна задняя конечность парализован, другой движется
4: полный паралич задних конечностей
5: полный паралич задних конечностей и недержание мочи
6: умирающий, затруднение дыхания, не ешьте и не пейте. Усыпить сразу.