Методическая статья

Крупномасштабные данио рерио основе В естественных условиях Малый экран Молекула

DOI:

10.3791/2243

⸱

30 декабря 2010 г.

 ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University School of Medicine, 4Research Medicine, Veterans Affairs TVHS, Vanderbilt University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио рерио стала мощным В естественных условиях Платформа для фенотипа основе экранов наркотиков и химических генетического анализа. Здесь мы демонстрируем, простым, практичным методом для крупномасштабного скрининга малых молекул с помощью рыбок данио эмбрионов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Учитывая их небольшой размер эмбриона, быстрое развитие, прозрачность, плодовитость, а также многочисленные молекулярные, морфологические и физиологические сходства с млекопитающими, данио стала мощным

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1) данио рерио сбора яиц

  1. Во второй половине дня до дня химических экран, созданный 10 до 20 танков данио разведения. Заполните каждый бак с водой из аквакультуры системы. Использование рыболовные сети, передачу один взрослый мужчина и одного-двух взрослых женщин, чтобы внутренний контейнер в каждом разведении танк. Отдельные мужские и женские рыб друг от друга перегородкой. Этикетка клетки и положил крышку над ними.
  2. С утра на экране, удалите делителей из разведения танков и позволяют данио к спариванию. В течение следующего 1 часа, позволяют оплодотворенной икры падать через решетку в нижней части каждой внутренней емкости.
  3. Через 1 час возвращения взрослых данио обратно в постоянное резервуаров, удалите внутренний контейнер и собирать яйца, напрягая воды в каждом разведении бака через фильтр пластиковый чая.
  4. Обратить фильтр по чашке Петри и промыть фильтр аккуратно, чтобы смыть яйца в чашке Петри с помощью вымыть бутылку с E3 среды.
  5. Все неоплодотворенные яйца, которые появляются непрозрачные, должны быть удалены с помощью одноразовой пипетки пластика. Каждый спаривания крест должно дать около 200 эмбрионов.

2) Arraying Эмбрионы в 96-луночных планшетах

  1. Передача около 5 эмбрионов в E3 среды в каждую лунку 96-луночного планшета с помощью стеклянной пипетки Пастера.
  2. Как только эмбрионы выстраиваются на 96-луночного планшета, удалите как можно больше E3 среды как возможного из скважин с помощью 12-канальной (30 - 300 мкл) пипетки, заботясь, чтобы не проколоть эмбриона. Использование 12-канальная пипетка, доставить 250 мкл E3 среде, содержащей канамицин 0.5μg/ml в каждую лунку как можно быстрее, чтобы не позволить эмбрионов высохнуть.
  3. Положите 96-луночных планшетах в 28,5 ° C инкубаторе, пока не достигнете желаемого стадии, когда соединения, которые будут добавлены.

3) Передача малых Библиотека Молекула

Хотя соединение передачи может быть автоматизирован с роботом каналов передачи данных, мы расскажем ручного способа переноса.

  1. Малые библиотеки молекулы, как правило, поставляются в 96-луночного формата, с каждого соединения хранится в ДМСО в качестве 10 фондовом мМ. Около 60 минут до эмбрионы достигают стадии, когда соединения должны быть добавлены, оттепель необходимое количество 96-луночного содержащих аликвоты малых молекул (источник пластины). Обратите внимание на серийный или другой идентификационный номер источника пластин. Чтобы свести к минимуму образование конденсата на пластинах, таяние может произойти в высыхания камеру, содержащую Drierite (WA HAMMOND DRIERITE CO, Ксения, штат Огайо).
  2. Кратко спином вниз пластин в настольные центрифуги оснащен мульти-луночного планшета адаптера.
  3. Удалить алюминиевой ленты уплотнения из исходных пластины. Использование 12-канальная пипетка, развести соединений в исходном пластину с концентрацией 0,5 мм (например, если, начиная с 250 аликвот нл акций 10мм, добавить 4,75 мкл ДМСО в каждую лунку).
  4. Когда эмбрионов в 96-луночного планшета (получателя пластины) достигают желаемого этапе служит 12-канальный (2-20 мкл) пипетки для передачи 2.5μL соединений (0,5 мм) от источника пластин в получатель чашки, содержащие эмбрионов.
  5. Запись идентификационный номер источника плит на пластины получателя эмбриона. Обложка получателя пластин теперь содержащих эмбрионы и соединений с крышками, осторожно перемешать, осторожно пластины вихрей, и поместите их в 28,5 ° C инкубатора.
  6. Обложка каждого источника пластины, содержащей неиспользованные малых молекул (0,5 мм) с алюминиевой ленты герметизации и место в -80 ° C морозильнике в течение длительного хранения.

4) Скрининг по воздействию малых молекул при визуальном осмотре фенотипов

  1. Перед выполнением экран, сформулировать конкретные критерии для того, что будет представлять собой "хит".
  2. В нужное время в развитии, удалите 96-луночных содержащего соединения обработанных эмбрионов из инкубатора и исследовать каждую лунку под стереомикроскопа. Для лучшей визуализации тонкие изменения, такие как изменения в кровеносной узор, фазового контраста инвертированный микроскоп может быть использован. Флуоресцентная микроскопия может быть использована для изучения возмущений выражения GFP или DsRed белков под тканеспецифические промоутера.
  3. Быстрое сканирование 96-луночных планшетах для любой ямы, в которой по крайней мере 3 из 5 эмбрионов выставку предписано "хит" фенотип. Запись личность пластину и также расположение каждого потенциального хита.
  4. Подтвердить потенциальных пострадавших от повторного тестирования эффектов соединения на нескольких доз (1 мкМ, 5 мкМ, 10 мкм и 50 мкм). Для каждой дозы, 10 эмбрионов проходят испытания в 0,5 мл E3 средств массовой информации в 48-луночный планшет формата. Сроки соединения дополнение для повторного тестирования должна быть идентична оригинальной скрининга. Хит подтверждается, когда вызвали фенотип воспроизводится на повторное тестирование compounг
  5. Определить хит соединения из базы данных малых молекул в химической библиотеки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При планировании данио основе химических экран, особое внимание должно быть обращено на надежность фенотипа на рассмотрении и фона скорость такой фенотип. Это особенно важно для экранов для химической супрессоров индуцированного фенотипа. Например, для фенотип вызванных теплового шока индукция трансгенов, условии, что вызывает фенотип воспроизводимо должны быть четко наметил перед началом экран, чтобы избежать неприемлемо высокий уровень ложных срабатываний. При тщательном планировании, данио химических экранов, которые...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Нет конфликта интересов объявлены.

Материалы

  1. Минимум 20 пар взрослых данио желаемого генотипа.
  2. Рыба сетей, Разведение танков, со съемной внутренней емкости и делителей (водной среды обитания).
  3. Чашки Петри (10 см).
  4. Пластиковые сито чай.
  5. Вымойте бутылку с указанной эмбриона воды.
  6. Одноразовые пипетки передачи полиэтилена.
  7. Полистирол 96-луночного круглым дном анализа пластин (Corning COSTAR; Лоуэлл, Массачусетс).
  8. Стекло пипетки Пастера (Fisher Scientific).
  9. Руководство пипетки насоса, 10 мл (Бел-художественных изделий, Пекваннок, Нью-Джерси).
  10. E3 среда эмбриона: 5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2, 0,33 мМ MgSO 4, содержащий 0,003% ПТУ (фенилтио-карбамид, Sigma, Сент-Луис, Миссури). ПТУ могут быть получены, как 10-кратный раствор, растворяя 0,3-г ПТУ в 1 л E3 медиа эмбриона. Растворы, содержащие ПТУ должны быть защищены от света покрытием алюминиевой фольгой.
  11. 12-канальная пипетка, 2-20 мкл (Eppendorf).
  12. 12-канальный пипетки, 3-300 мкл (Eppendorf).
  13. Одноразовые пипетки полистирола бассейна, 50 мл (Fisher Scientific).
  14. Малые библиотеки молекула структурно разнообразных соединений одетые в 96-WLL формата 10 мм складе в ДМСО. Каждый мастер пластина аликвоты в 96-и полипропилена хранения пластин (Corning), и хранится при температуре -80 ° С до использования.
  15. Алюминиевый уплотнительная лента для 96-луночных планшетах (Nunc, Рочестер, штат Нью-Йорк).
  16. ДМСО (Sigma, Сент-Луис, Миссури).
  17. Основные инкубатор, 28,5 ° С (Fisher Scientific).
  18. Стереомикроскоп в проходящем свете базы (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bayliss, P. E. Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish. Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).
  2. Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
  3. Hao, J. In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors. ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).
  4. Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling. Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).
  5. Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107, 1355-1358 (2003).
  6. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).
  7. Yu, P. B. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).
  8. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature reviews. 4, 35-44 (2005).
  9. Stern, H. M. Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant. Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).
  10. Peterson, R. T. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

zebrafish96Hedgehog

Похожие статьи