Методическая статья

Зажим Patch и перфузии Методы изучения ионных каналов, выраженные в Xenopus Ооцитов

DOI:

10.3791/2269

⸱

10 января 2011 г.

 ,  ,  , 
1Department of Energy, Environmental & Chemical Engineering, Washington University in St. Louis, 2Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis, 3Department of Biomedical Engineering and Cardiac Bioelectricity and Arrhythmia Center, Washington University in St. Louis

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ионный ток BK каналы записываются с использованием методов патч зажим. BK каналов выражаются в Xenopus ооцитов Путем введения информационной РНК. Внутриклеточного раствора в процессе записи патча зажим контролируется перфузии системы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, представленный здесь, предназначен для изучения активации большого проводимость, напряжение и Са 2 +-активированной K + (BK) каналов. Протокол также может быть использован для изучения структурно-функциональных отношений для других ионных каналов и рецепторов нейромедиаторов 1. BK каналов широко выражается в различных тканях и был замешан во многих физиологических функций, в том числе регулирование гладких мышц, частота настройки внутренних волосковых клеток и регуляции нейротрансмиттеров выпуск 2-6. BK каналы активируются деполяризацию мембраны и внутриклеточного Са 2 + и Mg 2 + 6-9. Таким образом, протокол предназначен для управления и напряжение мембраны и внутриклеточные решение. В этом протоколе РНК БК каналы вводят в Xenopus laevis ооциты (этап V-VI), а затем на 2-5 дней инкубации при 18 ° С 10-13. Мембранные патчи, которые содержат одну или несколько BK каналы вырезали с наизнанку конфигурации с помощью патча зажим методы 10-13. Внутриклеточной стороне патч озарен искомые решения во время записи, так что канал активации при различных условиях могут быть рассмотрены. Подводя итог, мРНК BK каналы вводят в Xenopus laevis ооциты выразить канала белков на ооцит мембраны; методы патч зажим используется для записи ток, протекающий через каналы в контролируемых напряжением и внутриклеточных решений.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Введение мРНК в ооциты

  1. Inject 0,05 - 50 нг РНК, которая была переписана в пробирке в Xenopus laevis ооциты (этап V-VI) с использованием Nanoject II Auto-Nanoliter Инжектор (Драммонд Научно компании, модель 3-000-204). Повторите инъекции на десятках ооцитов для каждой мРНК.
  2. Промойте ооциты вводят дважды используя ND-96 раствор (96 мМ хлорида натрия (NaCl, г-н 58,44 г / моль), 2 мМ хлорида калия (KCl, г-н 74,56 г / моль), 1,8 мМ хлорида кальция (CaCl 2 • 2H 2 O , г-н 147,02), 1 мМ хлорид магния (MgCl 2 • 6H 2 O, г-н 203,31 г / моль), 5 мм, 4 - (2-гидроксиэтил)-1-piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES, г-н 238,31 г / моль), 2,5 мм пируват натрия (г-н 110,04 г / моль) и 1x пенициллин-стрептомицина. рН 7,6), затем поместить их в пластину культуры и инкубировать при 18 ° С в течение 2 дней +.

2. Подготовка системы перфузии

figure-protocol-1
Иллюстрация Автоматизация ValveLink 16 перфузии системы. Перфузии система использует давление азота подтолкнуть перфузионные растворы из раствора резервуаров, через перфузии трубки, и карандаш перфузии и чаевых. Поток каждого потока перфузии решение контролируется одним клапан резервуара и один электронный клапан. В этом протоколе одного из водохранилищ не находится под давлением и функционирует как приемник отходов, а также для сброса давления механизма. (Фото взято из сайта http://www.autom8.com поставщика)

  1. Подключение трубки для перфузии карандашом. Включите электронный контроллер клапана и открытых электронных лампах.
  2. Чтобы гарантировать, что трубки и перфузии карандаш свободны от забивают и пузырьки воздуха, нажмите деионизированной (DI) воды через каждый трубопровод использованием шприц с деионизированной водой.
  3. Подключение трубки к решению резервуаров и открытых клапан газовый баллон для сжатого азота.
  4. Откройте клапан резервуара, чтобы заполнить трубопровод с резервуаром решение. Флик резервуар клапаном для удаления пузырьков в решение, если это необходимо. Закрыть клапан после трубки заполняется раствором.
  5. Заполните перфузии наконечник с водой и винт его на перфузию карандашом. Будьте осторожны, чтобы не ловушка пузыри, при подключении наконечник.
  6. Fix перфузии карандаш, чтобы ванна этапе с помощью пластилина. Убедитесь, что перфузия наконечник в ванне пространства. Перфузии система теперь установлена.
  7. Добавить DI воды в ванне. Убедитесь, что перфузия кончик погружается в воду.
  8. Испытание, что каждый перфузии решение выходит из перфузии наконечник правильно. Закрыть электронный клапан связан с трубкой отходов коллектор и открыть вентиль для одного перфузии решение на время (140 мМ гидроксида калия (КОН, М т 56,1 г / моль), 20 мм 4 - (2-гидроксиэтил) -1 - piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES, М т 238,31 г / моль), 2 мМ хлорида калия (KCl, М т 74,56 г / моль), 1 мМ этиленгликоль-бис (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetraacetic кислоты (EGTA, М т 380,35 г / моль), доводят рН до 7.1-7.2 от метансульфокислоты (мезо 3, М т 96,1 г / моль), Са 2 + или Mg 2 + добавляется к нужной концентрации при необходимости). Под микроскопом наблюдать струю перфузии жидкости выходит из перфузии чаевые. Закрыть клапан для перфузии раствора и открытым клапан для отходов мусора. Перфузии струи должны почти исчезнуть. Повторите то же испытание для всех решений перфузии.
  9. Когда вы убедились, что весь поток перфузионные растворы правильно, замените DI воды в ванну с ванной решение (140 мМ гидроксида калия (КОН, М т 56,1 г / моль), 20 мм 4 - (2-гидроксиэтил)-1-piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES, М т 238,31 г / моль), 2 мМ хлорида калия (KCl, М т 74,56 г / моль), доводят рН до 7.1-7.2 от метансульфокислоты (мезо 3, М т 96,1 г / моль)).

3. Патч Зажимные

  1. Перекрытия электрод Ag записи с AgCl перед каждым патч зажима сессии. Во-первых, удалите электродной проволоки из держателя пипетки и погрузите наконечник половине электродной проволоки в флакон, содержащий свежие отбеливателя в течение 15 минут. Это депозиты слоем AgCl на проводе.
  2. Промыть электродной проволоки деионизированной водой и промокните насухо. Затем установите Ag / AgCl электрод обратно в держатель пипетки.
  3. Подключите ванну (ссылка) электрода к headstage и поместить его в ванну. Это подготавливает электроды для записи.
  4. Теперь подготовим для сбора данных. Включите компьютер и подключить электронный ключ в порт принтера компьютера. Аппаратный ключ должен быть подключен для использования программного обеспечения сбора данных, который Хека импульса.
  5. Включите усилитель (Axon Instruments, АХОPATCH 200B) и начать Хека Pulse. Загрузите файл протокола и настроить параметры конфигурации, такие как Стимул Scale. Цель для настройки параметров конфигурации чтобы гарантировать, что тест потенциал в точности равна команды потенциал. Это подготавливает оборудования сбора данных.
  6. Подготовка ооцитов. Погрузитесь в яйцеклетку зачистки раствора (200 мМ N-метил-D-глюкамин (НМГ, М т 195,22 г / моль), 200 мМ аспартат (без K +) (М т 133,1 г / моль), 2 мМ хлорида калия (KCl , М т 74,56 г / моль), 10 мМ этиленгликоль-бис (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraacetic кислоты (EGTA, М т 380,35 г / моль), 1 мМ хлорид магния (MgCl 2 • 6H 2 O, M т 203,31 г / моль), 10 мм 4 - (2-гидроксиэтил)-1-piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES, М т 238,31 г / моль), рН до 7,4 на гидроксид натрия (NaOH, М т 40,0 г / моль) в течение 5 - 10 мин. зачистки решение отделяет желточной мембраны из плазмы мембрану, которая позволяет полоса желточной оболочки.
  7. Аккуратно полосы желточной мембраны из яйцеклетки с помощью двух пар щипцов. Devitellinized ооцитов крайне хрупкой и, следовательно, должны быть перемещены так же мало, как это необходимо.
  8. Осторожно, чтобы предотвратить разоблачение devitellinized ооцитов в воздух или пузырьки, используйте стеклянную пипетку заполнен достаточно решения для передачи яйцеклетки в баню. Это подготавливает яйцеклетку для записи.
  9. Подготовка патч пипеток. Вытяните стекло пипетки после вставки стекла капиллярная трубка (VWR International, Cat # 53432-921) в Саттер Р-97 Flaming / коричневый микропипетки Puller. Соблюдайте пипетки под микроскопом, чтобы определить форму наконечника и диаметром отверстия. Диаметр отверстия должен быть 2-4 мкм.
  10. Для уменьшения емкостного тока при записи и для обеспечения плавного наконечник, пальто наконечник воском, а затем огонь-польский его.
  11. Заполните пипетки, помещая кончик пипетки в раствор пипеткой (140 мМ гидроксида калия (КОН, М т 56,1 г / моль), 20 мм 4 - (2-гидроксиэтил)-1-piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES, М т 238,31 г / моль), 2 мМ хлорида калия (KCl, М т 74,56 г / моль), 2 мМ хлорид магния (MgCl 2 • 6H 2 O, M т 203,31 г / моль), доводят рН до 7.1-7.2 от метансульфоновой кислоты (мезо 3, М т 96,1 г / моль)) и рисования поршень. Это смачивает кончик.
  12. Заполните пипетку на 1 / 3 с пипеткой решение с помощью шприца и место пипеткой в ​​пипетку держатель с Ag / AgCl внутри электрода и контактирующих с пипеткой решение. Это готовит патч пипетки.
  13. Для акцизных наизнанку патч от подготовлены ооцитов, найти четкие края яйцеклетки под микроскопом. Перемещение патч пипетку близко к ооцитов использованием манипулятора. Запишите серийный сопротивления пипетки. Идеальное сопротивление серии патч пипетки 1-1,5 МОм при заполнении решение пипетки и погружен в ванну решение.
  14. Медленно нажмите пипетки против яйцеклетки до сопротивления примерно в два раза.
  15. Применить нежная всасывания на мембрану внутрь через всасывающую трубу, которая связана с пипеткой держатель до гига-ом печать получается. Стабилизировать патч, держа ее при напряжении -30 мВ в течение нескольких минут.
  16. Чтобы получить наизнанку патч, акцизов патч, быстро нажав пипеткой дальше в яйцеклетки и затем осторожно вытянуть ее.
  17. Наизнанку патч готов для зажима. Перемещение пипетки проведения наизнанку патч до 100 мкм от открытия перфузии чаевые.
  18. Закрыть электронный клапан для сбора отходов и открытое водохранилище клапан для желаемого перфузии решение
  19. Начните запись токи через патч. Изменение напряжения и перфузионные растворы как хотелось бы.
  20. Когда вы закончили запись, чистый перфузии трубки, карандаш и наконечника, проталкивание деионизированной воды, чтобы избежать засорения.

4. Представитель Результаты

Во время подготовки ооцитов для патч зажим, 5-10 мин лечение вскрышных решением было бы отделить желточной мембраны от плазматической мембраны, что позволяет зачистки желточной оболочки.

Идеальное сопротивление серии патч пипетки 1-1,5 МОм при заполнении решение пипетки и погружен в ванну решение.

Ниже приводится запись представитель дикого типа каналов Черный на патч мембраны яйцеклетки. Слева вверху, прямоугольной формы указывают на напряжение, приложенное к патч - второй шаг напряжение увеличивается с 50 мВ до 200 мВ с шагом 50 мВ. Ниже приводится соответствующая текущей следы, когда перфузия решение имеет номинальную 0 Са 2 + (свободный [Са 2 +] составляет около 0,5 нм). Вувеличение амплитуды тока показывает, что вероятность открытых каналов BK возрастает с увеличением напряжения. С правой стороны, тот же патч перфузия 1,0 мкМ Са 2 + при применении с тем же протоколом напряжения. Амплитуды тока возрастает при том же напряжении, что указывает на открытой вероятность возрастает с увеличением [Са 2 +].
figure-protocol-2

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Система ооцитов выражение идеально подходит для электрофизиологических характеристик напряжения зависит от ионных каналов из-за относительно низкой фоне эндогенной каналов. Кроме того, так как она является переходным системы экспрессии, она обеспечивает эффективный метод проведения мутагенеза изучение этих каналов. Тем не менее, следует отметить, что система ооцитов выражение отличается от таковой в клетках млекопитающих, таким образом, могут быть различия в пост-трансляционной модификации и ассоциации с различными подр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грантов R01-R01 и HL70393-NS060706 к JCJC является профессор биомедицинской инженерии на Спенсера Т. Олина фонда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Nanoject II Авто-нанолитровый инжекторDrummond Scientific3-000-204
P-97 Flaming/Brown Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97
и электронный контроллерAutoMate Scientific, Inc.ValveLink 16Внутренний диаметр перфузионного наконечника: 100 мкм
Инвертированный микроскопOlympus CorporationCKX31
Стеклянные пипеткиVWR international53432-921
Flaming/Brown Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97
УсилительAxon InstrumentsAXOPATCH 200B
Компьютерный интерфейсINSTRUTECH CorporationITC-18
HeadstageAxon InstrumentsCV 203BU
Перфузионная система

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
  2. Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
  3. Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
  4. Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
  5. Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
  6. Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
  7. Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
  8. Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
  9. Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
  10. Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
  11. Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
  12. Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
  13. Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Patch ClampPerfusion SystemXenopus OocytesBK ChannelIon ChannelmRNA InjectionInside Out PatchGiga SealVoltage ClampCalcium Activation

Похожие статьи