Плюрипотентных стволовых клеток, растущих в виде суспензии дифференцироваться в эмбриоидных тел (ЭТ). Здесь показано, как получить высокое качество EB cryosections полезны для изучения клеточных и молекулярных аспектов эмбриогенеза, сохраняя при этом свою организацию как агрегаты.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ плюрипотентных стволовых клеток с помощью Cryosections из эмбриоидные тела
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эмбриональных стволовых (ЭС) клеток плюрипотентные клетки, полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты ранней стадии эмбрионов млекопитающих 1. Важный этап в дифференцировку ЭС клеток образование эмбриоидные тела (ЭТ) агрегатов 2, 3. Е. Б. Формирование на основе спонтанной агрегации, когда ES клетки культивируют в не сторонник пластин. Трехмерная резюмирует Е. Б. многие аспекты раннего эмбриогенеза млекопитающих и дифференцироваться в трех зародышевых листков: эктодермы, мезодермы и энтодермы 4.
Иммунофлуоресценции и гибридизация широко используются методы выявления целевых белков и РНК присутствуют в клетках тканей раздел 5, 6, 7. Здесь мы приведем простой метод для получения высоких cryosections качество эмбриоидных органов. Этот подход опирается на пространственную ориентацию EB вложения в октябре следуют cryosection техники. В результате разделов может быть подвергнут широкий спектр аналитических процедур для характеристики популяции клеток, содержащих определенные белки, РНК или ДНК. В этом смысле подготовка EB cryosections (10 мкм) являются необходимыми инструментами для анализа окрашивания гистологии (например, гематоксилином и эозином, DAPI), иммунофлюоресценции (например Oct4, нестин) или на месте гибридизации. Эта техника также может помочь понять аспекты эмбриогенеза в отношении поддержания три-мерной сферической структуры ЭТ.
Протокол
1. Фиксация и Криоконсервация
Плюрипотентные стволовые клетки культивировали на эмбриональных фибробластов мыши (MEF) инактивированные митомицином С и поддерживается в DMEM/F12 дополнена с 20% нокаут сыворотке замены (КСР) и 8ng / мл фактора роста фибробластов (FGF-2). Для того, чтобы вызвать образование EB H9 клетки были переданы не соблюдают блюд и культивировали в течение 7 дней, поддерживаться в DMEM/F12 дополнена с 15% КСР 8.
Обратите внимание (!): Этот метод может быть использован для ЭТ получена в результате любого эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
- Сбор ЭТ от культуры блюдо с пипеткой.
- Передача ЭТ в 15 мл коническую трубку и ждать, пока материал опускается на дно трубки.
- Удаление средних и исправить ЭТ с 4% параформальдегида (PFA) решение в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.
Обратите внимание (!): Для восстановления на месте антиген гибридизации должно быть сделано для того, чтобы избежать перекрестной реакции с антителами ссылку в связи с использованием PFA 6,7. - Удалить PFA раствора и промыть PBS в течение 5 мин.
- ЭТ должны быть помещены в серийное разведение PBS-буферных растворах сахарозы (10, 20 и 30%, в последовательности) при 25-28 ° С, каждое решение должно быть заменено каждые 30 мин. Материал может быть в наличии в 30% растворе сахарозы при температуре 4 ° С до вложение ногу с октября
2. Ткань вложения, руководство и морозильные
- Осторожно собрать ЭТ из тюбика. Разряд столько раствора сахарозы насколько это возможно.
Обратите внимание (!): Очень важно, чтобы смочить внутреннюю стенку наконечник с раствором сахарозы перед сбором EBS. Эта процедура может избежать EB быть присоединены к концу. - Место ЭТ в форму и удалить остатки раствора сахарозы с фильтровальной бумаги.
Обратите внимание (!): Очень важно, чтобы не заполнить форму с ЭТ, чтобы избежать дублирования. - Заполните форму с октября медленно, стараясь не повторно приостанавливать EBS. После этого, поместите все EB в центре плесени и удаления пузырьков с пипеткой.
- Умеренно агитировать за 15 минут.
- Surround плесень с дробленым сухой лед, чтобы заморозить пробы. Октября должны быть полностью заморожены. На данный момент блоки могут храниться при температуре -70 ° С, в течение не менее одного года.
3. Cryosectioning Техника
- Удалить замороженных блоков от -70 ° C и место на криостате ранее охлаждают при температуре от -18 до -21 ° C.
Обратите внимание (!): Температура вне этого диапазона может привести к неприятности, как разделы керлинг, плавки или трещин. - Отсоедините блок октября из формы и поместите его в криостате поддержки за счет добавления новых октября
- Важно, чтобы ориентировать блок должным образом и привести его в соответствие параллельно краю лезвия.
Обратите внимание (!): Как ЭТ меньше, чем другие образцы тканей, этот шаг является чрезвычайно важным, чтобы минимизировать потери материала. - Октябрь блоки должны быть секционного поверхностно, пока поверхность плоскости получается. В шлифах (10 мкм) из ткани образца должны быть приняты и установлены на стеклах ранее окрашенных с 200 мг / мл поли L лизин (10 мкл на слайд) 9,10.
Обратите внимание (!): Чтобы избежать torned разделы обратить внимание на какой-либо ущерб на лезвие. - Все разделы должны быть воздушно-сухой в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем использоваться или храниться при температуре -70 ° С до использования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанный здесь метод обеспечивает простой в последующей протокол для получения PFA фиксированных тонких срезов криостат эмбриоидные тела полезно для иммунофлуоресценции и на месте гибридизации. В результате cryosections позволяют изучать клеточные и молекулярные аспекты человеческой эмбриональной дифференциации стволовых клеток, при сохранении их структуры и организации, агрегатов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана Fundação де Ампаро Pesquisa сделать Estado-ду-Риу-де-Жанейро (FAPERJ), Conselho Насьональ де Desenvolvimento Científico электронной Tecnológico (CNPq) и Национальным институтом Ciencia электронной Tecnologia (INCTC). Мы благодарны Бруно С. Паулсен и Алине Фернандес М. Б. для изображений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| D (+) сахароза | Реагент | Vetec | 228 | |
| Параформальдегид | Реагент | Rieden-de Haën | 16005 | |
| Раствор PBS | Реагент | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Гидробромид поли-L-лизина | Реагент | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL в воде |
| Соединение Tissue-Tek O.C.T. | Реагент | Sakura Finetek | P2636 | |
| Раствор сахарозы | Реагент | 10% раствор сахарозы в PBS w/v | ||
| Раствор сахарозы | Реагент | 20% раствор сахарозы в PBS w/v | ||
| Раствор сахарозы | Реагент | 30% раствор сахарозы в PBS w/v | ||
| Коническая пробирка | Инструмент | Techno Plastic Products | 91015 | коническая пробирка 15mL |
| Шейкер для планшетов | Инструмент | Biomixer | ||
| Криостат | Инструмент | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Форма для OCT-платформы | Инструмент | пластиковая форма-платформа |
Ссылки
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
- Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
- Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
- Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
- Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
- Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
- Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
- Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
