Анализ плюрипотентных стволовых клеток с помощью Cryosections из эмбриоидные тела

Summary

Плюрипотентных стволовых клеток, растущих в виде суспензии дифференцироваться в эмбриоидных тел (ЭТ). Здесь показано, как получить высокое качество EB cryosections полезны для изучения клеточных и молекулярных аспектов эмбриогенеза, сохраняя при этом свою организацию как агрегаты.

Abstract

Эмбриональных стволовых (ЭС) клеток плюрипотентные клетки, полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты ранней стадии эмбрионов млекопитающих ^1. Важный этап в дифференцировку ЭС клеток образование эмбриоидные тела (ЭТ) агрегатов ^{2, 3.} Е. Б. Формирование на основе спонтанной агрегации, когда ES клетки культивируют в не сторонник пластин. Трехмерная резюмирует Е. Б. многие аспекты раннего эмбриогенеза млекопитающих и дифференцироваться в трех зародышевых листков: эктодермы, мезодермы и энтодермы ^4.

Иммунофлуоресценции и гибридизация широко используются методы выявления целевых белков и РНК присутствуют в клетках тканей раздел ^{5, 6, 7.} Здесь мы приведем простой метод для получения высоких cryosections качество эмбриоидных органов. Этот подход опирается на пространственную ориентацию EB вложения в октябре следуют cryosection техники. В результате разделов может быть подвергнут широкий спектр аналитических процедур для характеристики популяции клеток, содержащих определенные белки, РНК или ДНК. В этом смысле подготовка EB cryosections (10 мкм) являются необходимыми инструментами для анализа окрашивания гистологии (например, гематоксилином и эозином, DAPI), иммунофлюоресценции (например Oct4, нестин) или на месте гибридизации. Эта техника также может помочь понять аспекты эмбриогенеза в отношении поддержания три-мерной сферической структуры ЭТ.

Protocol

1. Фиксация и Криоконсервация

Плюрипотентные стволовые клетки культивировали на эмбриональных фибробластов мыши (MEF) инактивированные митомицином С и поддерживается в DMEM/F12 дополнена с 20% нокаут сыворотке замены (КСР) и 8ng / мл фактора роста фибробластов (FGF-2). Для того, чтобы вызвать образование EB H9 клетки были переданы не соблюдают блюд и культивировали в течение 7 дней, поддерживаться в DMEM/F12 дополнена с 15% КСР ^8.

Обратите внимание (!): Этот метод может быть использован для ЭТ получена в результате любого эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

1. Сбор ЭТ от культуры блюдо с пипеткой.
2. Передача ЭТ в 15 мл коническую трубку и ждать, пока материал опускается на дно трубки.
3. Удаление средних и исправить ЭТ с 4% параформальдегида (PFA) решение в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.
   Обратите внимание (!): Для восстановления на месте антиген гибридизации должно быть сделано для того, чтобы избежать перекрестной реакции с антителами ссылку в связи с использованием PFA ^6,7.
4. Удалить PFA раствора и промыть PBS в течение 5 мин.
5. ЭТ должны быть помещены в серийное разведение PBS-буферных растворах сахарозы (10, 20 и 30%, в последовательности) при 25-28 ° С, каждое решение должно быть заменено каждые 30 мин. Материал может быть в наличии в 30% растворе сахарозы при температуре 4 ° С до вложение ногу с октября

2. Ткань вложения, руководство и морозильные

6. Осторожно собрать ЭТ из тюбика. Разряд столько раствора сахарозы насколько это возможно.
   
   Обратите внимание (!): Очень важно, чтобы смочить внутреннюю стенку наконечник с раствором сахарозы перед сбором EBS. Эта процедура может избежать EB быть присоединены к концу.
7. Место ЭТ в форму и удалить остатки раствора сахарозы с фильтровальной бумаги.
   
   Обратите внимание (!): Очень важно, чтобы не заполнить форму с ЭТ, чтобы избежать дублирования.
8. Заполните форму с октября медленно, стараясь не повторно приостанавливать EBS. После этого, поместите все EB в центре плесени и удаления пузырьков с пипеткой.
9. Умеренно агитировать за 15 минут.
10. Surround плесень с дробленым сухой лед, чтобы заморозить пробы. Октября должны быть полностью заморожены. На данный момент блоки могут храниться при температуре -70 ° С, в течение не менее одного года.

3. Cryosectioning Техника

11. Удалить замороженных блоков от -70 ° C и место на криостате ранее охлаждают при температуре от -18 до -21 ° C.
    
    Обратите внимание (!): Температура вне этого диапазона может привести к неприятности, как разделы керлинг, плавки или трещин.
12. Отсоедините блок октября из формы и поместите его в криостате поддержки за счет добавления новых октября
13. Важно, чтобы ориентировать блок должным образом и привести его в соответствие параллельно краю лезвия.
    
    Обратите внимание (!): Как ЭТ меньше, чем другие образцы тканей, этот шаг является чрезвычайно важным, чтобы минимизировать потери материала.
14. Октябрь блоки должны быть секционного поверхностно, пока поверхность плоскости получается. В шлифах (10 мкм) из ткани образца должны быть приняты и установлены на стеклах ранее окрашенных с 200 мг / мл поли L лизин (10 мкл на слайд) ^9,10.
    
    Обратите внимание (!): Чтобы избежать torned разделы обратить внимание на какой-либо ущерб на лезвие.
15. Все разделы должны быть воздушно-сухой в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем использоваться или храниться при температуре -70 ° С до использования.

Discussion

Описанный здесь метод обеспечивает простой в последующей протокол для получения PFA фиксированных тонких срезов криостат эмбриоидные тела полезно для иммунофлуоресценции и на месте гибридизации. В результате cryosections позволяют изучать клеточные и молекулярные аспекты человеческой эмбриональной дифференциации стволовых клеток, при сохранении их структуры и организации, агрегатов.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
D (+) Реактив сахарозы		Vetec	228
Параформальдегидный	реактив	Rieden-de Haë n	16005
Раствор PBS	Реагент	LGC Biotecnology	13-30259.05
Поли-L-лизина гидробромид		Реагент Sigma-Aldrich	P2636	200 мг/мл в воде
Ткань-Tek O.C.T. Составной	реагент	Сакура Finetek	P2636
			сахарозы	10% раствор сахарозы в PBS w/v
Реагент			сахарозы	20% раствор сахарозы в PBS с
реагентом			сахарозы	30% раствор сахарозы в PBS с
конической трубкой	инструмент	Techno Plastic Изделия	91015	15 мл коническая трубка
Шейкер для тарелок	Инструмент	Биомиксер
Инструмент Криостат		Инструмент Leica Microsystems	CM 1850
Пресс-форма для платформы OCT	Инструмент			Пластиковая форма для платформы