Адресная доставка вируса к кортикоспинальным нейронам у неонатальной крысы для изучения повреждения спинного мозга

Аннотация

Источник: Smit, R. D., et al. Нацеливание на кортикоспинальный тракт у неонатальных крыс с помощью двойного вирусного вектора с использованием комбинированной хирургии головного мозга и позвоночника. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео демонстрируется целенаправленная доставка вирусных векторов к кортикоспинальным нейронам у неонатальной крысы. Протокол позволяет точно экспрессировать гены с помощью антероградных и ретроградных инъекций вируса, облегчая исследования регенерации и пластичности нейронов после травмы спинного мозга.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Прямые инъекции в спинной мозг с целью нацеливания на окончания аксонов

1. С помощью кончика стеклянной иглы для инъекций приблизьтесь к средней линии спинного мозга, определив спинномозговую артерию. Однако, если позвоночная артерия заметно смещена от центра или отклоняется каким-либо образом, приблизьте среднюю линию, используя положение остистого отростка С2 и экстраполируя его вниз по длине позвоночника.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите вирус в инжектор, пипетируя ~5 μл на кусок парапленки, и расположите иглу так, чтобы кончик находился поверх капли вируса.
2. После идентификации расположите иглу сразу за пластинкой C5 примерно по средней линии и используйте ее в качестве точки отсчета. Затем с помощью микроманипулятора переместите иглу в боковом направлении вправо на 0,3 мм. Опускайте иглу до тех пор, пока она не коснется поверхности спинного мозга; С этой глубины вонзайте иглу на 0,6 мм в спинной мозг. При необходимости продолжайте вонзать иглу до тех пор, пока она не проколет спинной мозг; Затем втяните или опустите иглу на соответствующую глубину.
3. Введите 1 мкл ретро-аденоассоциированного вируса2-scCre со скоростью 250 нл/мин. После завершения инъекции подождите 2 минуты, пока вирус диффундирует в спинной мозг, прежде чем медленно извлекать иглу. Повторите инъекции, используя те же координаты латеральности и глубины еще в двух местах внутри спинномозгового окна, один в средней точке, а последний прямо перед пластинкой Т1.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Гибкая насадка для игл	World Precision Instruments	MF34G-5	Для очистки стеклянных игл и загрузки красного масла в стеклянные иглы.
Стеклянные капиллярные трубки	World Precision Instruments	4878	Для тянутых стеклянных игл - должны быть рассчитаны на нанолитровые инжекторы.
Микроманипулятор с нониусной шкалой	Kanetec	N/A	Для точного наведения во время операции.
Лабораторный стандартный стереотаксический инструмент	Toelting	51600	Для удержания неонатального стеротаксического держателя на месте
Лабораторный стандарт с адаптером для мышей и новорожденных	51615	Для фиксации неонатального черепа во время черепно-мозговой хирургии и спинальных инъекций
Микроскоп со световым и нониусным масштабом Окуляр	Leitz Wetzlar	N/A	Используется для визуализации и измерения скоса капиллярных трубок из вытянутого стекла в функциональные стеклянные иглы.
Контроллер насоса MicroSyringe	Precision Instruments	62403	Для контроля скорости впрыска.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	Для загрузки и впрыска вирусов контролируемым образом.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab Cre		плазмида
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (плазмида #44361)	Лаборатория Брайана Рота с помощью игл Addgene		DREADD
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Для использования со шприцами объемом 1 мл и 10 мл для введения инъекции животной модели.
Щипцы для зубов крысы	Roboz	RS-5152	Для захвата остистых отростков.
Стерильный физиологический раствор	Baxter Healthcare Corporation	281324	Для использования при очистке крови и для замены жидкостей после операции.
Хирургические перчатки	Н/Д	Н/Д	Для использования хирургом для поддержания стерильного поля во время операции.
Хирургическая грелка	Н/Д	/Д	Для поддержания температуры тела животного модели во время операции.
Хирургический микроскоп	Н/Д Н	/Д	Для улучшенной визуализации операционной раны.

World Н