$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
- Подготовка шприца для микроинъекций и микроинъектора к инъекции:
- Зафиксируйте каждый газонепроницаемый шприц для микроинъекций в стойке насоса для микроинъекций.
- Поместите кончик газонепроницаемого шприца в стерильную воду, содержащуюся в небольшой лодке для взвешивания, и осторожно взмахните поршнем, чтобы смазать внутреннюю проволоку. Равномерно потяните поршень до упора на насосе, чтобы наполнить его водой.
- Наденьте трубку PE20, подключенную к микроинъектору, на иглу 26 G (коричневая ступица), прикрепленную к шприцу объемом 1 мл, наполненному стерильной водой. Распылите стерильную воду через микроинъектор и проверьте форму и расстояние распыления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вода должна разбрызгиваться очень далеко и прямо из наконечника микроинжектора. Если струя не прямая, место впрыска будет неправильным. - Поместите стерилизованный микроинъектор на стерильное поле.
- Сдвиньте трубку с иглы, удерживая трубку микроинъектора в вертикальном положении, чтобы предотвратить капание воды, а также разрежьте трубку ниже области, поврежденной иглой.
- Слегка сдвиньте поршень шприца для микроинъекций вперед, чтобы создать каплю на конце иглы, и наденьте заполненную водой трубку PE20 (которая подключена к микроинъектору) на иглу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это создаст соединение жидкость-жидкость, которое обеспечит соответствующее обратное давление, которое может сместить засор, который может образоваться на кончике микроинжектора. - Полностью выдвиньте поршень вперед, чтобы подготовиться к загрузке образца и убедиться, что в микроинъекторе не осталось следов этанола.
- Проверьте настройку на наличие утечек, прикоснувшись к капле воды, образовавшейся на кончике микроинъектора, к чистой лабораторной салфетке несколько раз.
- ПРИМЕЧАНИЕ: При прикосновении к лабораторной салфетке должно образоваться только одно мокрое пятно. Если капель стало больше, значится утечка в системе.
- Избегайте утечек, контролируя нанесение суперклея и обрезая трубку PE20 острыми ножницами или лезвием бритвы в любое время, когда трубка PE20 удаляется из любого соединения.
- Оттяните поршень шприца назад на 0,2 мкл, создавая пузырь между стерильной водой в трубке PE20 / микроинъекторе и раствором, который нужно впрыснуть.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Этот пузырь предотвращает разбавление инъекции, загрязнение воды и позволяет контролировать процесс впрыска, поскольку он будет перемещаться во время впрыска. Должен быть получен одинарный твердый пузырь.
- Поместите микроинъектор в реагент, который нужно впрыснуть, и медленно потяните поршень шприца до упора.
- Подготовка животного к инъекции:
- Прижмите грудь крысы к груди экспериментатора. Очистите область вокруг канюль ватным аппликатором, смоченным в 70% этаноле (v/v).
- ПРИМЕЧАНИЕ: При правильном обращении мышей можно аккуратно удерживать в чашеобразной руке. В противном случае может потребоваться загривка.
- Снимите обтюраторы с помощью небольших щипцов и поместите их в весовую лодку с 70% этанолом (v/v).
- Выполнение инъекций:
- Поместите заполненный микроинъектор в канюлю. Нажмите кнопку «Старт» на насосе микровпрыска и следите за движением пузырьков.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться легкое давление, чтобы гарантировать, что микроинъекторы не поднимутся. Пузырь должен равномерно продвигаться вперед и полностью входить в микроинжектор.
- Извлеките микроинъекторы из канюли и замените обтюраторы после завершения инъекции и прохождения периода диффузии после инъекции.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Типичное время диффузии после инъекции составляет 2–4 минуты для фармакологических реагентов и 2–10 минут для вирусов. Если оставить микроинъектор в постинфузионном периоде, инъекция не будет возвращаться обратно вверх по канюлям, а не диффундировать в ткани. Разместите обтюраторы на боковой стороне наполненной этанолом весовой лодки, чтобы дать этанолу стечь, прежде чем снова вставлять его в канюлю.