Все процедуры по сбору проб были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Пролиферация и дифференцировка клеток lt-NES
ПРИМЕЧАНИЕ: индуцированные плюрипотентными стволовыми клетками длительного времени самообновляющиеся нейроэпителиальноподобные стволовые клетки (lt-NES) человека генерируются и трансдуцируются лентивирусным вектором, несущим зеленый флуоресцентный белок (GFP) под конститутивным промотором (клетками GFP-lt-NES). Флаконы, содержащие 3 x 106 клеток, хранятся при температуре −150 °C до использования.
1. Подготовка биржевых решений и медиа
1. Разведите 100 мкг основного фактора роста фибробластов (bFGF) в 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS)-0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) до исходной концентрации 10 мкг/мл. Приготовьте 100 мкл аликвот.
2. Разведите 100 г эпидермального фактора роста (EGF) в 10 мл PBS-0,1% BSA, чтобы получить исходную концентрацию 10 мкг/мл. Приготовьте 100 мкл аликвот.
3. Дополнение Aliquot 50x B27 в объеме 100 μL на аликвоту.
4. Разведите 10 мг поли-L-орнитина в 100 мл деионизированной воды, чтобы получить исходную концентрацию 100 мкг/мл. Сделайте 1 мл аликвоты.
5. Приготовьте 30 μL аликвот 1,20 мг/мл мышиного ламинина.
6. Разведите 10 мл трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (0,25%) в 90 мл PBS до исходной концентрации 0,025%. Подготовьте 1 мл аликвот.
7. Разведите 0,025 г ингибитора трипсина в 50 мл PBS до исходной концентрации 0,5 мг/мл. Подготовьте 1 мл аликвот.
8. Разведите 10 μг Wnt3a (член семейства сайтов интеграции MMTV бескрылого типа 3A) в 1 мл PBS-0,1% BSA, чтобы получить концентрацию акций 10 μг/мл. Таким же образом готовят BMP4 (костный морфогенетический белок 4). Аликвота в объеме 100 μл.
9. Разведите 1 мг циклопамина в 2,5 мл диметилсульфоксида (ДМСО) до конечной концентрации 400 мкг/мл и сделайте 100 мкл аликвот.
10. Подготовьте базовую среду (Таблица 1) и среду для дифференциации (DDM, Таблица 2) и храните при температуре 4 °C до 2 недель.
2. Покрытие посуды для культуры
style
1. Чтобы предварительно покрыть чашки для культивирования клеток GFP-It-NES во время пролиферации или дифференцировки, разведите поли-L-орнитин 1:100 в деионизированной воде и добавьте 5 мл раствора в колбу T25. Инкубировать в течение ночи при комнатной температуре (RT).
2. Промойте пластины, покрытые поли-L-орнитином, 1x деионизированной водой и 1x PBS.
3. Для клеток GFP-It-NES в процессе пролиферации, разведите мышиный ламинин на 1:500 в PBS и инкубируйте не менее 2 часов при 37 °C. Для клеток GFP-It-NES при дифференцировке мышиный ламинин разбавляют в соотношении 1:100 в PBS и инкубируют не менее 2 ч при 37 °C.
3. Распространение ячеек GFP-lt-NES
1. Нагрейте 5 мл (для умывания) и 5 мл (для посева) основной среды в двух разных пробирках по 15 мл.
2. Быстро разморозьте один флакон с ячейками GFP-lt-NES при 37 °C, перенесите их в промывочную трубку и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут.
3. Осторожно аспирируйте среду, не касаясь гранулы, и повторно суспендируйте клетки в 1 мл предварительно подогретой основной среды. Перенесите клеточную суспензию в посевную трубку, содержащую основную среду с добавлением факторов пролиферации: EGF (10 нг/мл), bFGF (10 нг/мл) и B27 (10 нг/мл). Поместите клетки в колбу T25, покрытую поли-L-орнитином/ламинином.
4. Кормите клетки факторами пролиферации каждый день. Замените носитель, если он пожелтеет. Пассаж клеток происходит каждые третий-четвертый день (через 1 день после того, как они достигнут 100% слияния).
4. Разделение клеток GFP-lt-NES для пролиферации и дифференцировки
1. Предварительно подогрейте 5 мл основной среды на колбу (чтобы собрать клетки) плюс общий объем, необходимый для их повторного посева.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пассаж проводится в соотношении 1:3 для поддержания пролиферации клеток в пролиферации, требующем 15 мл основной среды, и в разведении 1:6 для начала дифференцировки, требующем 30 мл основной среды.
2. Удалите среду из колбы для клеточных культур путем аспирации и добавьте 500 μL предварительно подогретого 0,025% трипсина. Инкубировать в течение 5-10 мин при RT. Отслойка клеток может быть подтверждена под стандартным световым микроскопом при 10-кратном увеличении.
3. Добавьте равный объем ингибитора трипсина (конечная концентрация 0,5 мг/мл), а затем 5 мл теплой основной среды. Отделите и соберите клетки, аккуратно пипетируя вверх и вниз. Переложите клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение 5 минут при 300 x g.
4. Чтобы сохранить пролиферацию клеток, переложите в соотношении 1:3 свежую основную среду с добавлением факторов пролиферации и повторите шаг 1.3.4.
5. Корковая дифференцировка клеток GFP-lt-NES
1. На 0-й день ресуспендируйте клетки (для использования для дифференцировки) в 30 мл основной среды с добавлением факторов пролиферации и поместите их в шесть колб с дифференцировочным покрытием T25 (разделение 1:6).
2. В день 1 измените половину среды на DDM и добавьте факторы пролиферации в половине их концентрации.
3. На 2-й день полностью измените среду на DDM, добавив дифференцирующие факторы: BMP4 (10 нг/мл), Wnt3a (10 нг/мл) и циклопамин (400 нг/мл).
4. На 4-й день добавьте только факторы дифференциации. Замените носитель, если он пожелтеет.
5. На 6-й день измените среду на DDM с дополнением BMP4 и Wnt3a. На этом этапе циклопамин удаляется.
6. На 7-й день отсоедините ячейки, как указано в шаге 1.4.2 и шаге 1.4.3.
2. Трансплантация клеток GFP-lt-NES в органотипические срезы hACtx
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань коры головного мозга взрослого человека (hACtx) должна быть культивирована за 1 неделю до трансплантации клеток. Чтобы облегчить процедуру трансплантации, необходимо удалить 2 мл среды hACtx с верхней части вставки, чтобы предотвратить всплытие ткани.
1. Ресуспендируйте корково праймированные клетки GFP-lt-NES (начиная с шага 1.5.6) в холодном чистом матрице базальной мембраны (см. Таблицу материалов) в концентрации 1 x 105 клеток/мкл и перенесите раствор в меньшую стерильную пробирку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процедуры трансплантации все материалы (наконечники пипеток, трубки, капилляры и т. д.) должны быть предварительно охлаждены, чтобы избежать затвердевания геля. Разморозьте гель матрицы базальной мембраны на льду в течение 30 минут перед его использованием.
2. Соберите клеточную суспензию в холодный стеклянный капилляр, соединенный с резиновой соской для отсасывания. Вводите клеточную суспензию небольшими каплями (около 1 мкл каждая), вкалывая полусухой срез ткани в различные места.
3. Инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут, чтобы гель затвердел. Перенесите пластину из инкубатора обратно в колпак и осторожно добавьте 2 мл среды hACtx в верхнюю часть вкладыша для полного погружения ткани.
4. Заменяйте питательную среду свежей средой hACtx один раз в неделю.